Chef1発現プラスミドのコドン脱最適化DHFR選択可能なマーカーを使用して、組換えタンパク質収量の改善

Chef1発現プラスミドは、中国のハムスター伸長因子1（Chef1）ハウスキーピング遺伝子の調節領域を利用して、中国のハムスター卵巣（CHO）細胞で安定した組換えタンパク質発現を促進します。メトトレキサート誘発DHFR増幅がない場合に高力価のプールが生成されるため、安定したChef1細胞株の急速な発達は可能です。メトトレキサートによるDHFR活性を阻害すると、トランスフェクトされた細胞に対する選択圧が増加し、DHFR遺伝子増幅や転写活性ゲノム部位への統合など、細胞の生存を確保するために代償性イベントをもたらす可能性があります。メトトレキサート増幅はしばしば細胞株の生産性が向上しますが、時間のかかるプロセスです。ここでは、野生型DHFR選択と比較してリンクされた組換えタンパク質の発現が改善されるハムスターコドンの好みを利用したマウスDHFR選択可能なマーカーのコドン脱最適化を介して選択の強さを高めるための新しいメカニズムについて説明します。DHFR遺伝子の翻訳性を最適化すると、CHOトランスフェクションプールと導出されたクローンのDHFRタンパク質の発現レベルが低下することを示します。DHFRの発現が低いと、プールのトランスフェクション効率が低いことが示されているトランスフェクション選択のストリンジェンシーが増加し、プールとクローンの両方で組換えタンパク質発現の増加と相関します。これらの結果は、時間のかかる遺伝子増幅ステップなしで、細胞株の発達中の選択の強迫性を高め、組換えタンパク質産生を改善するための新しいメカニズムを示しています。

The CHEF1 expression plasmid utilizes regulatory domains of the Chinese Hamster Elongation Factor 1 (CHEF1) housekeeping gene to drive stable recombinant protein expression in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. Rapid development of stable CHEF1 cell lines is possible, in part, because high titer pools are produced in the absence of methotrexate-induced DHFR amplification. Inhibiting DHFR activity with methotrexate increases the selection pressure on transfected cells and can result in a compensatory event to ensure cell survival, such as dhfr gene amplification or integration into a transcriptionally active genomic site. Methotrexate amplification often results in improved cell line productivity but it is a time-consuming process. Herein, we describe a novel mechanism to increase selection stringency via codon deoptimization of the mouse dhfr selectable marker utilizing hamster codon preference that results in improved expression of a linked recombinant protein compared to wild-type DHFR selection. We show that deoptimizing the translatability of the dhfr gene reduces the expression level of the DHFR protein in CHO transfection pools and derived clones. Lower DHFR expression increases the transfection selection stringency, shown as lower transfection efficiency in pools, and correlates with increased recombinant protein expression in both pools and clones. These results demonstrate a new mechanism for increasing selection stringency and improving recombinant protein production during cell line development without time-consuming gene amplification steps.