速度論的メカニズムMycobacterium Tuberculosis H37RVからの脱ヒドロキネートシンターゼの金属要件の決定と分析：抗TB薬物の機能ベースの合理的設計における重要なステップ

毎年発生する結核（TB）の新しい症例の数は世界的に増加しています。人間の結核の主な原因剤であるMycobacterium結核の薬物耐性株の移動、社会経済的剥奪、HIVの共感染、および世界中の結核症例の増加に貢献しています。病原体の生存に不可欠であり、シキメート経路の酵素などの宿主に存在しないタンパク質は、新しい抗TB薬の開発に魅力的な標的です。ここでは、M。tuberculosis脱子様シンターゼ（MTDHQ）の金属要件と速度論的メカニズムの決定について説明します。真の定常状態の運動パラメータの決定とリガンド結合データは、MTDHQS触媒化学反応が急速な平衡ランダムメカニズムに従うことを示唆しています。EDTAによる治療は、MTDHQの活性を完全に廃止し、CO（2+）とZn（2+）の添加により、それぞれ酵素活性の完全かつ部分的な回復がもたらされました。過剰なZn（2+）はMTDHQS活性を阻害し、同位体の微量回体測定データは2つの連続的な結合部位を明らかにしました。これは、二次抑制部位の存在と一致しています。また、誘導結合プラズマ原子発光分析による金属濃度の測定値を報告します。MTDHQの反応中に、それぞれNAD（+）とNADHの環状還元と酸化の定数は、一回ターンオーバーの実験条件下で、停止したフロー計器によって監視されました。これらの結果は、抗TB薬物としてさらに評価できるこの酵素の阻害剤の合理的な（関数ベースの）設計を導くのに役立つMTDHQの作用モードをよりよく理解することを提供します。

The number of new cases of tuberculosis (TB) arising each year is increasing globally. Migration, socio-economic deprivation, HIV co-infection and the emergence of drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the main causative agent of TB in humans, have all contributed to the increasing number of TB cases worldwide. Proteins that are essential to the pathogen survival and absent in the host, such as enzymes of the shikimate pathway, are attractive targets to the development of new anti-TB drugs. Here we describe the metal requirement and kinetic mechanism determination of M. tuberculosis dehydroquinate synthase (MtDHQS). True steady-state kinetic parameters determination and ligand binding data suggested that the MtDHQS-catalyzed chemical reaction follows a rapid-equilibrium random mechanism. Treatment with EDTA abolished completely the activity of MtDHQS, and addition of Co(2+) and Zn(2+) led to, respectively, full and partial recovery of the enzyme activity. Excess Zn(2+) inhibited the MtDHQS activity, and isotitration microcalorimetry data revealed two sequential binding sites, which is consistent with the existence of a secondary inhibitory site. We also report measurements of metal concentrations by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry. The constants of the cyclic reduction and oxidation of NAD(+) and NADH, respectively, during the reaction of MtDHQS was monitored by a stopped-flow instrument, under single-turnover experimental conditions. These results provide a better understanding of the mode of action of MtDHQS that should be useful to guide the rational (function-based) design of inhibitors of this enzyme that can be further evaluated as anti-TB drugs.