共焦点フラップによる結合拡散速度論を分析するための定量的アプローチ

細胞で発生する重要なタイプの相互作用のほとんどは、結合拡散型プロセスとして特徴付けられ、拡散係数（d）や結合速度定数（k（on）およびk（off）などの運動速度定数によって定量化できます。）。共焦点FRAPは、細胞内結合拡散速度論の定量的分析のための潜在的に重要なツールですが、そのような分析から正確な運動定数を確実に抽出する方法は依然として未解決の問題です。この目的のために、この研究では、スポットフォトブリーチジオメトリのFRAP式の閉形式方程式に基づいて、細胞内結合拡散プロセスの共焦点FRAPベースの測定の新しい分析モデルであると思われるものを開発しました。このアプローチには、非結合種と結合種の両方の拡散を可能にする結合拡散モデルが組み込まれており、光退色中に発生する結合拡散を補償します。さらに、パラメトリックの多重性の問題に対処するために、拘束されていない種と非結合種のDが知られている場合、効果的な拡散サブリジームのフィッティングパラメーターの数を減らすスキームを提案します。RasのCaaxを介した結合の運動速度定数を小胞体の膜に測定することにより、この方法を検証し、K（on）〜255/sおよびk（off）〜31/sの結合定数を取得します。

Most of the important types of interactions that occur in cells can be characterized as binding-diffusion type processes, and can be quantified by kinetic rate constants such as diffusion coefficients (D) and binding rate constants (k(on) and k(off)). Confocal FRAP is a potentially important tool for the quantitative analysis of intracellular binding-diffusion kinetics, but how to dependably extract accurate kinetic constants from such analyses is still an open question. To this end, in this study, we developed what we believe is a new analytical model for confocal FRAP-based measurements of intracellular binding-diffusion processes, based on a closed-form equation of the FRAP formula for a spot photobleach geometry. This approach incorporates a binding diffusion model that allows for diffusion of both the unbound and bound species, and also compensates for binding diffusion that occurs during photobleaching, a critical consideration in confocal FRAP analysis. In addition, to address the problem of parametric multiplicity, we propose a scheme to reduce the number of fitting parameters in the effective diffusion subregime when D's for the bound and unbound species are known. We validate this method by measuring kinetic rate constants for the CAAX-mediated binding of Ras to membranes of the endoplasmic reticulum, obtaining binding constants of k(on) ∼ 255/s and k(off) ∼ 31/s.