TIRF顕微鏡における単一分子FRET分解能の制限の定義

単一分子FRET（SMFRET）は、ナノスケールの生物学の研究の分子ルーラーとして長い間使用されてきました（〜2〜10 nm）。総内部反射蛍光（TIRF）Förster共鳴エネルギー移動（TIRF-FRET）顕微鏡のSMFRETにより、複数の生体分子を同時に、高い時間的および空間分解能と同時に研究することができます。技術の解決の制限で動作するには、ノイズとエラーの主要な原因を調査し、厳密に定量化することが不可欠です。TIRF-FRET解像度の限界を定量化するために、DNA標準の理論的予測、シミュレーション、高度な画像分析、および詳細な特性評価を使用しました。主要なノイズ源の理論的記述を提示します。これは、個々の分子の短絡SMFRET測定値（<200 ms）の結果と非常に一致していました（単一分子のアンサンブルの測定とは対照的に）。個々の分子の長い時間尺度（> 200ミリ秒）、および単一分子のアンサンブルから得られたFRET分布の場合、理論的予測を超えた有意な広がりが観察されました。この広がりの原因を調査しました。個々の分子の測定では、実験ノイズの分析により、20 msの時間分解能で0.08のFRET変化の最大分解能を予測することができます。単一分子のアンサンブルの測定では、1000 msの時間分解能を持つ1つのベースペアの距離差の解決と、80 msの時間分解能を持つ2つのベースペアの違いを示します。私たちの仕事は、DNA処理機械（DNAおよびRNAポリメラーゼ、ヘリカーゼなど）を含む多くの生体分子に関する超高分解能TIRF-FRET研究の道を開きます。そのメカニズムは、1つのスケールの距離変化によってしばしば特徴付けられますDNAベースペア。

Single-molecule FRET (smFRET) has long been used as a molecular ruler for the study of biology on the nanoscale (∼2-10 nm); smFRET in total-internal reflection fluorescence (TIRF) Förster resonance energy transfer (TIRF-FRET) microscopy allows multiple biomolecules to be simultaneously studied with high temporal and spatial resolution. To operate at the limits of resolution of the technique, it is essential to investigate and rigorously quantify the major sources of noise and error; we used theoretical predictions, simulations, advanced image analysis, and detailed characterization of DNA standards to quantify the limits of TIRF-FRET resolution. We present a theoretical description of the major sources of noise, which was in excellent agreement with results for short-timescale smFRET measurements (<200 ms) on individual molecules (as opposed to measurements on an ensemble of single molecules). For longer timescales (>200 ms) on individual molecules, and for FRET distributions obtained from an ensemble of single molecules, we observed significant broadening beyond theoretical predictions; we investigated the causes of this broadening. For measurements on individual molecules, analysis of the experimental noise allows us to predict a maximum resolution of a FRET change of 0.08 with 20-ms temporal resolution, sufficient to directly resolve distance differences equivalent to one DNA basepair separation (0.34 nm). For measurements on ensembles of single molecules, we demonstrate resolution of distance differences of one basepair with 1000-ms temporal resolution, and differences of two basepairs with 80-ms temporal resolution. Our work paves the way for ultra-high-resolution TIRF-FRET studies on many biomolecules, including DNA processing machinery (DNA and RNA polymerases, helicases, etc.), the mechanisms of which are often characterized by distance changes on the scale of one DNA basepair.