特定のRNA結合タンパク質の高収量親和性浄化法：ヒト胎盤からの鉄調節因子の分離

特定のRNA結合タンパク質の親和性精製のための簡単な方法について説明します。RNAのタンパク質結合部位に対応するDNA配列は、T7ウイルスプロモーターとポリ（A）トラックの間のin vitro転写ベクターにサブクローニングされます。ポリアデニル化RNA転写産物は、ポリ（U）セファロースに結合され、その後、ヘパリンアガロース上で充填された細胞抽出物とインキュベートされます。具体的には、吸着タンパク質は、高塩溶出により親和性マトリックスから高収量と純度で回収されます。この方法を使用して、フェリチンおよびトランスフリン受容体mRNAの5 'および3'非翻訳配列の特定のパリンドローム元素に結合する細胞質タンパク質である鉄調節因子（IRF）を分離しました。この調節因子の活性化と結合は、トランスフリン受容体mRNAの安定性の増加とフェリチン翻訳の阻害と相関しています。ヒト胎盤からの精製因子は、ゲルクロマトグラフィーのモノマーとして移動しますが、SDS/Pageで分析すると、95および100 kDaの分子量がある2つのタンパク質の等モル量で存在します。2つのタンパク質は、等電点の同一性とRNAタンパク質複合体を形成する特異性によって判断されるように、非常に関連しています。

We describe a simple method for the affinity purification of specific RNA-binding proteins. DNA sequences corresponding to the protein-binding site of the RNA are subcloned into an in vitro transcription vector between the T7 viral promoter and a poly(A) track. A polyadenylated RNA transcript is bound to poly(U)-Sepharose and subsequently incubated with a cellular extract prepurified on heparin-agarose. Specifically adsorbed proteins are recovered in high yield and purity from the affinity matrix by high salt elution. Using this method we isolated the iron regulatory factor (IRF), a cytoplasmic protein which binds to specific palindromic elements in the 5' and 3' untranslated sequences of ferritin and transferrin receptor mRNA, respectively. Activation and binding of this regulatory factor correlates with increased transferrin receptor mRNA stability and inhibition of ferritin translation. The purified factor from human placenta migrates as a monomer in gel chromatography, but is present in equimolar amounts of two proteins with molecular weights of 95 and 100 kDa when analysed by SDS/PAGE. The two proteins are highly related as judged by the identity of their isoelectric points and their specificity to form RNA-protein complexes.