ロタウイルスは、NSP4ビロポリン活性によってカルシウム恒常性を破壊します

多くのウイルスは細胞内カルシウムの恒常性を変化させます。小胞体（ER）膜貫通糖タンパク質であるロタウイルス非構造タンパク質4（NSP4）は、ホスホリパーゼC非依存性経路を介して細胞質Ca（2+）（[Ca（2+）] Cyto）の細胞内レベルを増加させます。ウイルスの複製と形態形成。ただし、[Ca（2+）] CyTOを増加させるNSP4ドメインとメカニズムは不明です。膜に挿入し、ウイルスの完全性とイオンの恒常性を破壊してウイルスの侵入、アセンブリ、または放出を促進する膜の完全性とイオンの恒常性を破壊する小さな疎水性ウイルスタンパク質のクラスであるビロポリンの構造的特性を持つNSP4ドメイン（アミノ酸[AA] 47〜90）を特定しました。変異分析により、NSP4ビロポリン活性は、保存されたリジンクラスターの下流の両親媒性αヘリックドメインによって媒介されることが示されました。リジンクラスターは、ビロポリンドメインの積分膜挿入を指示し、ビロポリン活性にとって重要でした。上皮細胞では、野生型NSP4の発現は遊離細胞質Ca（2+）のレベルを3.7倍増加させましたが、NSP4ビロポリン変異体は[Ca（2+）] CyTOの低レベルをERで維持し、ERで保持しました。ロタウイルス感染細胞のウイルス複製およびアセンブリ部位を囲むPunctaと呼ばれる細胞質の小胞構造を形成することができませんでした。[Ca（2+）] CyTOがタプシガルギンで薬理学的に増加した場合、ビロポリン変異体は涙点を形成し、カルシウムレベルと涙点形成の上昇がNSP4の明確な機能であり、NSP4が直接的または間接的に細胞質カルシウムレベルの上昇に直接反応することを示しています。NSP4ビロポリン活性は、ロタウイルスの複製とビリオンアセンブリを調節する重要なイベントである[Ca（2+）] CyTOのNSP4を介した上昇のメカニズムを確立します。

Many viruses alter intracellular calcium homeostasis. The rotavirus nonstructural protein 4 (NSP4), an endoplasmic reticulum (ER) transmembrane glycoprotein, increases intracellular levels of cytoplasmic Ca(2+) ([Ca(2+)]cyto) through a phospholipase C-independent pathway, which is required for virus replication and morphogenesis. However, the NSP4 domain and mechanism that increases [Ca(2+)]cyto are unknown. We identified an NSP4 domain (amino acids [aa] 47 to 90) that inserts into membranes and has structural characteristics of viroporins, a class of small hydrophobic viral proteins that disrupt membrane integrity and ion homeostasis to facilitate virus entry, assembly, or release. Mutational analysis showed that NSP4 viroporin activity was mediated by an amphipathic α-helical domain downstream of a conserved lysine cluster. The lysine cluster directed integral membrane insertion of the viroporin domain and was critical for viroporin activity. In epithelial cells, expression of wild-type NSP4 increased the levels of free cytoplasmic Ca(2+) by 3.7-fold, but NSP4 viroporin mutants maintained low levels of [Ca(2+)]cyto, were retained in the ER, and failed to form cytoplasmic vesicular structures, called puncta, which surround viral replication and assembly sites in rotavirus-infected cells. When [Ca(2+)]cyto was increased pharmacologically with thapsigargin, viroporin mutants formed puncta, showing that elevation of calcium levels and puncta formation are distinct functions of NSP4 and indicating that NSP4 directly or indirectly responds to elevated cytoplasmic calcium levels. NSP4 viroporin activity establishes the mechanism for NSP4-mediated elevation of [Ca(2+)]cyto, a critical event that regulates rotavirus replication and virion assembly.