Escherichia coli DNAポリメラーゼI（クレノウフラグメント）およびショウジョウバエメラノガスターポリメラーゼアルファプライマーゼ複合体複合体を使用することにより、ユニークな部位でM4TGとM4TA塩基ペアを形成する比較効率

ユニークな部位でのO4-メチルチミン（M4T）を含む25-MERオリゴヌクレオチドテンプレートの合成が報告されています。使用された配列は、in vitroおよびin vivoでのO6-メチルグアニンの突然変異頻度を決定するために、以前に研究した配列に類似しています。M4Tまたは変更されていないTを含むテンプレートをプライマーエクステンションゲルアッセイで使用して、M4TまたはTの反対側のDGTPおよびDATPによる取り込みの運動パラメーターを決定しました。ポリメラーゼアルファプリマーゼ複合体（Polアルファ）を​​使用しました。VMAX/km比に基づいて、M4T.Gのペアリングは、M4T.AとT.Gの両方よりも10倍以上優先されました。2つのポリメラーゼは、M4T.Gペアを含む調査されたすべてのペアの形成の頻度にほぼ同一の値を与え、クレノウフラグメントの3 '--- 5'エキソヌクレアーゼ活性がそのようなペアを効率的に編集しないことを示唆しています。M4T.Gを超えた拡張は、KlenowとPol Alphaの両方で実証されました。同様の速度論的実験では、非常に高い3 '--- 5'エキソヌクレアーゼ活性を持つバクテリオファージT4 DNAポリメラーゼは、Gとは対照的にM4Tとは反対のGの安定した組み込みを可能にします。アルキル化修復がないことと、以前のin vivo研究と一致している突然変異誘発に関する定性的データをさらに提供します。M4Tはt ---- C遷移を引き起こします。

Synthesis of a 25-mer oligonucleotide template containing O4-methylthymine (m4T) at a unique site is reported. The sequence used is analogous to that studied previously to determine the mutation frequency of O6-methylguanine in vitro and in vivo. The templates containing m4T or unmodified T were used in a primer-extension gel assay to determine kinetic parameters for incorporation by DNA polymerases of dGTP and dATP opposite either m4T or T. Both Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment, Kf) and Drosophila melanogaster polymerase alpha-primase complex (pol alpha) were used. On the basis of the Vmax/Km ratios, the pairing of m4T.G was preferred over that of both m4T.A and T.G by more than 10-fold. The two polymerases gave almost identical values for the frequency of formation of all pairs investigated including m4T.G pairs, suggesting that the 3'----5' exonuclease activity of the Klenow fragment does not efficiently edit such pairs. Extension beyond m4T.G was demonstrated with both Klenow and pol alpha. In similar kinetic experiments, bacteriophage T4 DNA polymerase, which has a very high 3'----5' exonuclease activity, allows stable incorporation of G opposite m4T in contrast to G opposite T. This kinetic approach allows quantitation of the mutagenic potential in the absence of alkylation repair and additionally provides qualitative data on mutagenesis that are in accord with our previous in vivo studies showing that replication of m4T causes T----C transitions.