マウス肝臓ミクロソームにおける8-メトキシプソラレンおよびシトクロムP-450の不可逆的不活性化の生体活性化：モノクローナル抗体による修飾、薬物代謝の阻害、および共有結合付加物の分布

8-MOPのin vitro生物活性化は、雄のCD-1マウスの肝臓微生物で研究されました。40 microM [14C] 8-mop、共有結合結合（平均+/- S.D.）との10分間のインキュベーションでは、それぞれ1.8 +/- 0.4、3.1 +/- 0.6および5.4 +/- 0.4 nmol/mgタンパク質でした。マウスのミクソームは、車両、フェノバルビタール、またはベータナフソフラボン（BNF）で3日間前処理しました。3-メチルコラントレン（P1-450およびP3-450）によって誘導されるシトクロムP-450のアイソザイムを認識するモノクローナル抗体（MAB 1-7-1）は、8-MOP（-57％）および共生生の代謝を選択的に阻害しました。BNFで前処理したマウスのミクロソームでの代謝物（-40％）の結合は、フェノバルビタールまたはビヒクルで前処理したマウスのミクロソームには影響しませんでした。マウスのフェノバルビタールおよび未知のアイソザイムによって誘導されるラットシトクロムP-450の主要なアイソザイムを認識するモノクローナル抗体2-66-3は、車両と前処理したマウスのミクロソームにおける8-MOP代謝物の共有結合結合を強化しました（+74％）、フェノバルビタール（+44％）またはBNF（+31％）は、8モップの消失に影響を与えません。40ミクローム8-MOPによるBNF前処理マウスからの肝臓ミクロソームのプレインキュベーションは、時間依存的に7-エトキシクマリンデエチラーゼの活性を低下させました。40 microM 8-mopで10分間のプレインキュベーションは、VMAXを3.4から1.2 nmol/min/mgタンパク質に減少させ、ミカエリス定数を46から90マイクロムに増加させ、7-エトキシクマリンデエチラーゼの混合競合的および非競争的阻害を実証しました。システインは、8-MOPの反応性中間体の4分の3を閉じ込めましたが、7-エトキシクマリンデエチラーゼ活性の不可逆的阻害またはシトクロムP-450の45％スペクトル損失を防ぐのに効果がありませんでした。システインは、おそらく8-MOPからシトクロムP-450の代謝産物の不可逆的な結合を妨げなかったために効果がなかったからでしょう。8-MOPがシトクロムP-450を備えたシトクロムP-420または代謝産物間媒介複合体を形成したというスペクトルの証拠はありませんでした。これらの発見は、8-MOPによるシトクロムP-450の不可逆的な不活性化が、反応性代謝物によるアポタンパク質の修飾によって引き起こされるという仮説を支持しています。

The in vitro bioactivation of 8-MOP was studied in liver microsomes of male CD-1 mice. In 10-min incubations with 40 microM [14C]8-MOP, covalent binding (mean +/- S.D.) was 1.8 +/- 0.4, 3.1 +/- 0.6 and 5.4 +/- 0.4 nmol/mg protein, respectively, in microsomes from mice pretreated for 3 days with vehicle, phenobarbital or beta-naphthoflavone (BNF). A monoclonal antibody (MAb 1-7-1), which recognizes isozymes of cytochrome P-450 induced by 3-methylcholanthrene (P1-450 and P3-450), selectively inhibited the metabolism of 8-MOP (-57%) and covalent binding of its metabolites (-40%) in microsomes from mice pretreated with BNF, but had no effect in microsomes of mice pretreated with phenobarbital or vehicle. Monoclonal antibody 2-66-3, which recognizes the major isozymes of rat cytochrome P-450 induced by phenobarbital and unknown isozymes in the mouse, enhanced the covalent binding of 8-MOP metabolites in microsomes of mice pretreated with vehicle (+74%), phenobarbital (+44%) or BNF (+31%) without affecting the disappearance of 8-MOP. Preincubation of liver microsomes from BNF-pretreated mice with 40 microM 8-MOP decreased the activity of 7-ethoxycoumarin de-ethylase in a time-dependent manner. Preincubation with 40 microM 8-MOP for 10 min decreased the Vmax from 3.4 to 1.2 nmol/min/mg protein and increased the Michaelis constant from 46 to 90 microM, thus demonstrating mixed competitive and noncompetitive inhibition of 7-ethoxycoumarin de-ethylase. Cysteine trapped three-fourths of the reactive intermediates of 8-MOP but was ineffective in preventing the irreversible inhibition of 7-ethoxycoumarin de-ethylase activity or the 45% spectral loss of cytochrome P-450. Cysteine was ineffective probably because it did not prevent the irreversible binding of metabolites of 8-MOP to cytochrome P-450. There was no spectral evidence that 8-MOP formed cytochrome P-420 or metabolite-intermediate complexes with cytochrome P-450. These findings support the hypothesis that irreversible inactivation of cytochrome P-450 by 8-MOP is caused by modification of the apoprotein by reactive metabolites.