LC-MS/MSを使用した新しい化学物質の評価のためのin vitro、高スループット、7つのCYPカクテル阻害アッセイ

低タンパク質含有量を備えた特定のCYPプローブ基質（カクテルアッセイ）を使用して、プールされたヒト肝臓マイクロソームにおける7つの主要なシトクロムP450（CYP）酵素の生体異物化合物媒介阻害の同時特性評価のための検証済みの方法、および高速3分間の3分間LC-MS/MS分析方法について説明します。このカクテルアッセイで使用された特定のCYP基質には、フェナセチン（CYP1A2）、ブプロピオン（CYP2B6）、アモジアキン（CYP2C8）、トルブタミド（CYP2C9）、S-メフェニトイン（CYP2C19）、デクストロメートルファン（CYP2D6）、および5）LC-MSメソッドには、前述の7つのCYP基板と、それぞれの主要な代謝産物と1つの内部標準Labetalolが組み込まれました。交差検証解析では、アッセイ内の各CYPプローブ基質の濃度は、他のCYP活性に対する効果（すなわち、阻害または活性化）を最小限に抑えました。さらに、複数のプローブ基質、すなわちカクテルアッセイのアッセイ条件は、既知のCYP阻害負債と10個の独自化合物を持つ18個の化合物を使用して、単一プローブ基質アッセイに対して検証されました。このカクテルアッセイで測定された阻害定数（KI）は、27のCYP阻害剤すべての単一プローブ基質アッセイの抑制定数（個々のプローブ基質ごとにR（2）≥0.77）と高度に相関していました。この7つのCYP阻害カクテルアッセイにより、高スループットの創薬設定での主要なCYPアイソフォームの阻害の化合物を評価する効率が向上しました。

A validated method for the simultaneous characterization of xenobiotic compound-mediated inhibition of seven major cytochrome P450 (CYP) enzymes in pooled human liver microsomes through the use of specific CYP probe substrates (cocktail assay) with low protein content, and a rapid, three minute LC-MS/MS analytical method is described. The specific CYP substrates used in this cocktail assay included phenacetin (CYP1A2), bupropion (CYP2B6), amodiaquine (CYP2C8), tolbutamide (CYP2C9), S-mephenytoin (CYP2C19), dextromethorphan (CYP2D6), and midazolam (CYP3A4/5). The LC-MS method incorporated the aforementioned seven CYP substrates along with their respective major metabolites, and one internal standard, labetalol. In a cross-validation analysis, the concentrations of each CYP probe substrate in the assay had minimal effect (i.e., inhibition or activation) on the other CYP activities. Furthermore, the assay conditions for the multiple probe substrate, ie., cocktail assay, were validated against the single probe substrate assay using 18 compounds with known CYP inhibition liabilities and 10 proprietary compounds. The inhibitory constant (Ki) determined with this cocktail assay was highly correlated (R(2) ≥ 0.77 for each individual probe substrate) with that of the single probe substrate assay for all 27 CYP inhibitors. This seven CYP inhibition cocktail assay has increased the efficiency to assess compounds for inhibition of the major CYP isoforms in a high throughput, drug discovery setting.