そのよく知られている阻害剤U73122によるヒトホスホリパーゼCの直接活性化

ホスホリパーゼC（PLC）酵素は、主にイノシトールを含む膜リン脂質からの極頭群の加水分解を通じて、多くの細胞機能に関与する調節タンパク質の重要なファミリーです。U73122（1-（6-（（17β-3-メトキシエストラ-1,3,5）） - トリエン-17-イル）ヘキシル）-1H-ピロール-2,5-ジオン）、これらの酵素の活性を阻害することが報告されている小分子はほとんどありませんが、多様な実験的表現型にPLCを関与させるための薬理学的ツールとして広く適用されています。この研究の目的は、U73122とPLCの間の分子相互作用をよりよく理解することでした。したがって、ヒトPLCβ3（HPLCβ3）に対するU73122の効果は、細胞のないミセル系で評価されました。驚くべきことに、U73122は濃度および時間依存的にHPLCβ3の活性を増加させました。EC50 = 13.6±5μmで酵素活性の最大8倍の増加が観察されました。U73122によるHPLCβ3の活性化には、酵素活性化がチオールを含むヌクレオファイル、l-チェステイン、グルタチオンによって減衰されるという観察によって証明されるように、システインの共有結合修飾が必要でした。質量分析分析により、8つのシステインでU73122との共有結合反応が確認されましたが、完全なアルキル化なしで最大の活性化が達成されました。修飾された残基は、LC/MS/MSペプチドシーケンスによって同定されました。興味深いことに、U73122（10μM）もHPLCγ1（> 10倍）およびHPLCβ2（〜2倍）を活性化しました。PLCΔ1は活性化も阻害も阻害されませんでした。したがって、報告されている抑制性の可能性とは対照的に、U73122はいくつかの精製されたPLCを阻害できませんでした。これらのPLCのほとんどはU73122によって直接活性化され、活性化のための簡単なメカニズムが提案されています。これらの結果は、PLCアイソザイムの一般的な阻害剤としてのU73122の使用を再評価する必要性を強く示唆しています。

Phospholipase C (PLC) enzymes are an important family of regulatory proteins involved in numerous cellular functions, primarily through hydrolysis of the polar head group from inositol-containing membrane phospholipids. U73122 (1-(6-((17β-3-methoxyestra-1,3,5(10)-trien-17-yl)amino)hexyl)-1H-pyrrole-2,5-dione), one of only a few small molecules reported to inhibit the activity of these enzymes, has been broadly applied as a pharmacological tool to implicate PLCs in diverse experimental phenotypes. The purpose of this study was to develop a better understanding of molecular interactions between U73122 and PLCs. Hence, the effects of U73122 on human PLCβ3 (hPLCβ3) were evaluated in a cell-free micellar system. Surprisingly, U73122 increased the activity of hPLCβ3 in a concentration- and time-dependent manner; up to an 8-fold increase in enzyme activity was observed with an EC50=13.6±5 μm. Activation of hPLCβ3 by U73122 required covalent modification of cysteines as evidenced by the observation that enzyme activation was attenuated by thiol-containing nucleophiles, l-cysteine and glutathione. Mass spectrometric analysis confirmed covalent reaction with U73122 at eight cysteines, although maximum activation was achieved without complete alkylation; the modified residues were identified by LC/MS/MS peptide sequencing. Interestingly, U73122 (10 μm) also activated hPLCγ1 (>10-fold) and hPLCβ2 (∼2-fold); PLCδ1 was neither activated nor inhibited. Therefore, in contrast to its reported inhibitory potential, U73122 failed to inhibit several purified PLCs. Most of these PLCs were directly activated by U73122, and a simple mechanism for the activation is proposed. These results strongly suggest a need to re-evaluate the use of U73122 as a general inhibitor of PLC isozymes.