変異および化学修飾黄色蛍光タンパク質（YFP）における双方向蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）蛍光タンパク質バリアントを使用して、細胞内の高分子の生体分子運動を研究するために使用されます。蛍光化学レーベルを利用した分子内FRETは、特定の配列を検出するために核酸化学に適用されています。しかし、蛍光タンパク質における分子内FRETのバイオテクノロジー応用は悪用されていません。この研究は、蛍光タンパク質と共役化学標識の間の分子内FRETを示しています。蛍光タンパク質は化学フルオロフォアの付着のために修飾され、共役によって生成された新規FRETペアはMDCC（435/475） - シトリン（516/529）およびシトリン - アレクサフロア（568/603）です。これらのタンパク質 - ラベルペアは強い分子内FRETを示し、エネルギー伝達効率は、標識されたタンパク質と非標識タンパク質の発光強度の比の時間進化に基づいて決定されました。標識がタンパク質の異なる部位で共役している場合、効率はMDCC-Citrineで0.79および0.89、シトリン - アレキサ蛍光の蛍光蛍光が0.24および0.65であることがわかりました。Förster距離とフルオロフォア間の平均距離も決定されました。ここで説明する双方向のアプローチは、FRETベースのセンサーの設計に関する新しい洞察を提供できます。

Fluorescence resonance energy transfer (FRET) using fluorescent protein variants are used for studying the associations and biomolecular motions of macromolecules inside the cell. Intramolecular FRET utilizing fluorescent chemical labels has been applied in nucleic acid chemistry for detection of specific sequence. However, the biotechnological applications of intramolecular FRET in fluorescent proteins have not been exploited. This study demonstrates the intramolecular FRET between fluorescent protein and conjugated chemical label whereby FRET occurs from inside to outside and vice versa for fluorescent protein. The fluorescent protein is modified for the attachment of chemical fluorophores and the novel FRET pairs created by conjugation are MDCC (435/475)-Citrine (516/529) and Citrine-Alexa fluor (568/603). These protein-label pairs exhibited strong intramolecular FRET and the energy transfer efficiency was determined based on the time evolution of the ratio of emission intensities of labeled and unlabeled proteins. The efficiency was found to be 0.79 and 0.89 for MDCC-Citrine and 0.24 and 0.65 for Citrine-Alexa Fluor pairs when the label is conjugated at different sites in the protein. Förster distance and the average distance between the fluorophores were also determined. The bidirectional approach described here can provide new insights into designing FRET-based sensors.