バクテリア不飽和脂肪酸生合成の生地リプレッサーの同族プロモーターへの複雑な結合

2つの転写調節因子、FADRアクティベーターとFABRリプレッサー、大腸菌の不飽和脂肪酸の生合成を制御します。FABRは、不飽和脂肪酸合成に必要な2つの遺伝子FABAとFABBの発現を抑制し、FABAおよびFABBプロモーターをin vitroで結合するために、不飽和チオエステル（アシルキャリアタンパク質またはCOAの）の存在を必要とすることが報告されています。。ΔFADR株に外因性不飽和脂肪酸がない場合に不飽和脂肪酸合成がブロックされ、FABAとFABBの転写速度が不飽和チオエステルの欠如により影響を受けないことを発見したin vivo実験を報告します。in vivoの結果と以前のin vitroの結果の間の矛盾を調べるために、in vitro転写翻訳システムを使用して、大腸菌およびビブリオコレーラブリの活性的でネイティブな折り畳まれた形態を取得しました。FABRは、不飽和アシルチオエステルがない場合、FABAとFABBの両方の無傷のプロモーター領域を結合したが、2つのプロモーターを異なる方法で結合することを報告します。Native Fabr Bound FABAプロモーター領域は、標準FABR結合部位が隣接するFADR結合部位と重複する隣接シーケンスを含めることにより拡張されていることを条件にしています。対照的に、FABBオペレーターへの結合にも隣接シーケンスが必要でしたが、非固有のシーケンスで十分です。しかし、不飽和チオエスターは、拘束されていない両方のプロモーターの最小限のFABRオペレーターサイトへのファブル結合を可能にしました。したがって、不飽和チオエステルリガンドは、FABR/標的DNA相互作用には必須ではありませんでしたが、結合を強化するために作用しました。ゲルモビリティシフトデータと生体内発現データは、プロモーター要素の著しく類似した配置にもかかわらず、FADRが主にFABA発現を調節するのに対し、FABRはFABB発現の支配的な調節因子であることを示しています。また、大腸菌ファブリの発現は自動調節されていないことも報告しています。補完、QRT-PCR、および脂肪酸組成分析により、V。CholeraeFabrが不飽和脂肪酸合成の機能的リプレッサーであることが実証されました。ただし、大腸菌とは対照的に、ゲルモビリティシフトアッセイは、大腸菌もV. cholerae布もV. cholerae fabbプロモーターをバインドしていないことを示しましたが、両方のタンパク質はV. cholerae fabaプロモーターを効率的に結合しました。この非対称性は、V。CholeraeFabbプロモーター領域内のFABR結合部位がないためであることが示されました。

Two transcriptional regulators, the FadR activator and the FabR repressor, control biosynthesis of unsaturated fatty acids in Escherichia coli. FabR represses expression of the two genes, fabA and fabB, required for unsaturated fatty acid synthesis and has been reported to require the presence of an unsaturated thioester (of either acyl carrier protein or CoA) in order to bind the fabA and fabB promoters in vitro. We report in vivo experiments in which unsaturated fatty acid synthesis was blocked in the absence of exogenous unsaturated fatty acids in a ΔfadR strain and found that the rates of transcription of fabA and fabB were unaffected by the lack of unsaturated thioesters. To examine the discrepancy between our in vivo results and the prior in vitro results we obtained active, natively folded forms of the E. coli and Vibrio cholerae FabRs by use of an in vitro transcription-translation system. We report that FabR bound the intact promoter regions of both fabA and fabB in the absence of unsaturated acyl thioesters, but bound the two promoters differently. Native FabR bound the fabA promoter region provided that the canonical FabR binding site is extended by inclusion of flanking sequences that overlap the neighbouring FadR binding site. In contrast, although binding to the fabB operator also required a flanking sequence, a non-specific sequence could suffice. However, unsaturated thioesters did allow FabR binding to the minimal FabR operator sites of both promoters which otherwise were not bound. Thus unsaturated thioester ligands were not essential for FabR/target DNA interaction, but acted to enhance binding. The gel mobility shift data plus in vivo expression data indicate that despite the remarkably similar arrangements of promoter elements, FadR predominately regulates fabA expression whereas FabR is the dominant regulator of fabB expression. We also report that E. coli fabR expression is not autoregulated. Complementation, qRT-PCR and fatty acid composition analyses demonstrated that V. cholerae FabR was a functional repressor of unsaturated fatty acid synthesis. However, in contrast to E. coli, gel mobility shift assays indicated that neither E. coli nor V. cholerae FabRs bound the V. cholerae fabB promoter, although both proteins efficiently bound the V. cholerae fabA promoter. This asymmetry was shown to be due to the lack of a FabR binding site within the V. cholerae fabB promoter region.