骨芽細胞様細胞の分化と鉱化の誘導因子としての小分子PKA特異的環状アンプアナログ

骨芽細胞の分化は、骨形成、骨の修復、再生のための重要なランドマークです。ただし、異なるシグナル伝達メカニズムによって制御される非常に複雑なプロセスです。いくつかのグループは、環状アデノシン単リン酸（cAMP）シグナル伝達システムが骨芽細胞の細胞分化の調節に関与していることを報告しています。それにもかかわらず、これまで、このプロセスに関連するcAMP分子の主な役割は議論の余地があります。さらに、骨芽細胞の分化を支配する基礎となるcAMP依存シグナル伝達カスケードは明らかにされていません。この研究では、PKA特異的小分子cAMPアナログ、6-BNZ-CAMP、100 µmでの骨芽細胞様MC3T3-E1細胞の増殖、分化、および鉱化におけるcAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）シグナル伝達の役割を調査しました。アルカリホスファターゼ（ALP）活性、Runt転写因子2（RUNX2）、オステオポンチン（OPN）、および骨酸化タンパク質発現を骨芽細胞特異的マーカーとして使用して、骨芽細胞分化を実証しました。さらに、細胞外マトリックスのカルシウム測定は、マトリックスの鉱化または石灰化の特徴として採用されました。ここでは、小分子6-BNZ-CAMPによるPKAの活性化が骨芽細胞様MC3T3-E1細胞の骨芽細胞分化とマトリックスの鉱化を誘導することを報告します。さらに、6-BNZ-CAMPは、細胞増殖研究で明らかにされているように、細胞に対する細胞毒性を誘導しません。したがって、これらの発見に基づいて、PKA特異的小分子6-BNZ-CAMPは、骨regene系の工学中に骨組織を修復および再生するための新しい骨誘導成長因子として役立つ可能性があることを提案します。

Osteoblastic differentiation is an important landmark for bone formation, bone repair and regeneration; however, it is a very complex process controlled by different signalling mechanisms. Several groups have reported that the cyclic adenosine monophosphate (cAMP) signalling system is responsible for regulating osteoblast cell differentiation. Nonetheless, to date, the principle role of the cAMP molecules related to this process remains controversial. Moreover, the underlying cAMP-dependent signalling cascade governing the osteoblastic differentiation has not been clarified. In this study we investigated the roles of the cAMP-dependent protein kinase A (PKA) signalling in proliferation, differentiation and mineralization of osteoblast-like MC3T3-E1 cells, using the PKA-specific small molecule cAMP analogue, 6-Bnz-cAMP, at 100 µM. Alkaline phosphatase (ALP) activity, runt transcription factor 2 (Runx2), osteopontin (OPN) and osteocalcin (OCN) protein expressions were used as osteoblast-specific markers to demonstrate osteoblastic differentiation. Further, calcium measurement of the extracellular matrix was employed as the hallmark of matrix mineralization or calcification. We report here that activation of PKA by the small molecule 6-Bnz-cAMP induces osteoblastic differentiation and matrix mineralization of osteoblast-like MC3T3-E1 cells. Moreover, 6-Bnz-cAMP does not induce cytotoxicity to the cells, as revealed by our cell proliferation studies. Therefore, based on these findings, we propose that the PKA-specific small molecule 6-Bnz-cAMP may serve as a novel bone-inducing growth factor for repairing and regenerating bone tissues during bone-regenerative engineering.