バイモルクル蛍光補完（BIFC）を使用したタンパク質相互作用のプラント視覚化において

はじめに存在性蛍光補完（BIFC）分析により、生細胞におけるタンパク質間相互作用の直接的な視覚化が可能になります。この方法は、さまざまな生物のさまざまな発現システムに正常に適合しています。BIFCは、これらの断片に融合した2つの関連性タンパク質の相互作用によって結ばれた場合、強化された黄色の蛍光タンパク質（EYFP）の断片により蛍光錯体の形成に基づいています。これらのタンパク質の相互作用により、蛍光が回復し、タンパク質複合体の空間局在パターンの視覚化が可能になります。相互作用がないと、蛍光タンパク質の再組み立てが防止され、バックグラウンド蛍光のみで結果が生じます。二分子蛍光補完の特異性は、相互作用インターフェイスが変異しているタンパク質の並列解析によって確認する必要があります。このプロトコルは、ニコチアナ・ベンサミアナ葉細胞におけるBIFCアッセイのアグロバクテリウム媒介過渡発現プロトコルについて説明しています。この方法は、高い変換速度（細胞の最大90％）を示し、単一細胞内の複数のタンパク質の同時発現を可能にします。したがって、この発現システムは、細胞複合体の局在化を測定するために、BIFC複合体の形成を伴う蛍光標識タンパク質の共局在分析を可能にします。さらに、N。benthamianaの葉のタンパク質相互作用アッセイにより、異なる時点でのタンパク質相互作用の調査が可能になり、プロトプラストで通常毒性のあるタンパク質の分析を可能にし、表皮細胞と葉植物プロトプラストでの比較タンパク質相互作用調査を可能にします。

INTRODUCTIONBimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis enables direct visualization of protein-protein interactions in living cells. This method has been successfully adapted to a variety of expression systems in different organisms. BiFC is based on the formation of a fluorescent complex by fragments of the enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) when brought together by the interaction of two associating proteins fused to these fragments. Interaction of these proteins restores fluorescence and allows the visualization of spatial localization patterns of protein complexes. Absence of interaction prevents reassembly of the fluorescent protein and results only in background fluorescence. The specificity of bimolecular fluorescence complementation must be confirmed by parallel analysis of proteins in which the interaction interface has been mutated. This protocol describes the Agrobacterium-mediated transient expression protocol for BiFC assays in Nicotiana benthamiana leaf cells. This method exhibits a high transformation rate (up to 90% of the cells) and allows the simultaneous expression of multiple proteins in single cells. Therefore, this expression system enables colocalization analyses of fluorescently labeled proteins with the formation of BiFC complexes for determination of cellular complex localization. In addition, protein interaction assays in N. benthamiana leaves permit the investigation of protein interactions at different time points of expression, allow analysis of proteins that are normally toxic in protoplasts, and enable comparative protein interaction investigation in epidermal cells as well as in mesophyll protoplasts.