修正されたNBT染色方法を使用した植物の葉におけるスーパーオキシドの定量的決定

はじめに：植物では、ROS（反応性酸素種）レベルは、蓄積が細胞死につながる不可逆的な損傷を引き起こすため、厳しく調節されています。しかし、ROSの蓄積は、生物的または非生物的ストレスの下での植物シグナル伝達において重要な役割を果たします。ROSの蓄積を評価するためにさまざまな方法が報告されましたが、それらは植物をモデル化するか、定性的情報のみを提供することに制限されています。 目的：組織化学染色のニトロブルーテトラゾリウム（NBT）の減少後に生成されたホルマザンの選択的抽出に基づいて、植物組織で生成されたスーパーオキシドラジカルを定量化する簡単な方法を開発します。 方法論：植物の葉を標準的なNBT法で染色し、組織で沈殿したホルマザンをクロロホルムを使用して選択的に抽出しました。有機相を乾燥させ、ホルマザン残基をジメチルスルホキシド - 水酸化物に溶解し、分光光度測定により定量しました。この方法は、さまざまなストレス条件下でイチゴ植物の葉でテストされました。 結果：ストレス条件にさらされた葉から抽出されたホルマザンは、純粋なホルマザンを使用して標準溶液から得られたものと同様の吸収スペクトルを示しました。キャリブレーション曲線は、0.5〜8 µgの範囲内で、吸光度とホルマザン量の間の線形関係を示しました。結果は、ホルマザンが葉組織の固体残基に保持されていることを示唆しました。このプロトコルにより、さまざまな応力条件下で生成されたスーパーオキシドラジカルを定量化することができました。 結論：クロロホルムにより、定量的決定を妨げる可能性のある潜在的な内因性、外因性、または手続き型のアーティファクトの選択的なホルマザン抽出と除去が可能になりました。このプロトコルは、従来の定性的NBT組織化学染色法を使用して植物組織で生成されるスーパーオキシドを定量化するために使用できます。

INTRODUCTION: In plants, the ROS (reactive oxygen species) level is tightly regulated because their accumulation produces irreversible damage leading to cell death. However, ROS accumulation plays a key role in plant signaling under biotic or abiotic stress. Although various methods were reported to evaluate ROS accumulation, they are restricted to model plants or provide only qualitative information. OBJECTIVE: Develop a simple method to quantify superoxide radicals produced in plant tissues, based on the selective extraction of the formazan produced after nitroblue tetrazolium (NBT) reduction in histochemical staining. METHODOLOGY: Plant leaves were stained with a standard NBT method and the formazan precipitated in tissues was selectively extracted using chloroform. The organic phase was dried and formazan residue dissolved in dimethylsulfoxide-potassium hydroxide and quantified by spectrophotometry. The method was tested in strawberry plant leaves under different stressing conditions. RESULTS: Formazan extracted from leaves subjected to stress conditions showed similar absorption spectra to those obtained from standard solutions using pure formazan. Calibration curves showed a linear relationship between absorbance and formazan amounts, within the range 0.5-8 µg. Outcomes suggested that formazan was retained in the solid residue of leaf tissues. This protocol allowed us to quantify superoxide radicals produced under different stress conditions. CONCLUSIONS: Chloroform allowed a selective formazan extraction and removal of potential endogenous, exogenous or procedural artefacts that may interfere with the quantitative determination. This protocol can be used to quantify the superoxide produced in plant tissues using any traditional qualitative NBT histochemical staining method.