酵素結合免疫スポット（ELISPOT）アッセイを使用して、IFN-GAMMAおよびIL-5を産生する個々のマウス脾臓T細胞の検出

マウスサイトカインを定量化するためにいくつかの感度と特異的アッセイが開発されていますが、これらのアッセイでは、個々の細胞を生成する特定のサイトカインと相関させることはできません。この研究の目的は、インターフェロンガンマ（IFN-GAMMA）またはインターロイキン-5（IL-5）のいずれかを分泌する個々のT細胞を検出するための敏感で再現可能な方法を開発することでした。IFN-GAMMA（R4-6A2）およびIL-5（TRFK-5）へのモノクローナル抗体を使用して、96ウェルプレートをニトロセルロースベースでコーティングするために、酵素結合免疫スポット（ELISPOT）アッセイの適応を使用しました。。マウス脾臓T細胞は、非刺激またはコンカナバリンA（CONA）または植物骨凝集素（PHA）で活性化され、個々の井戸で培養されました。インキュベーション後、細胞を除去し、結合したサイトカインはビオチン化MAB抗IFN-GAMMA（XMG 1.2）または抗IL-5（TRFK-4）のいずれかでプローブし、それに続いてアビジン - ペルオキシダーゼが続きました。3-アミノ-9-エチルカルバゾールで発達した斑点は離散的であり、解剖顕微鏡で列挙されていました。未刺激の脾臓T細胞には、サイトカイン特異的斑点細胞（SFC）の数が少ないが、かなりの数のサイトカイン産生細胞を誘導するには、マイトジェンによる24〜72時間の活性化が必要でした。マイトジェン刺激脾臓CD4+ T細胞が評価された場合、ほぼ等しい数のIFN-GammaおよびIL-5 SFCが見られました。すべてのマイトジェン活性化脾臓T細胞の約20〜30％が、これら2つのサイトカインの少なくとも1つを産生しました。組換えIFN-ガンマ（RIFN-GAMMA）またはRIL-5を含む抗IL-5 mAbを伴うビオチン化抗IFN-GAMMAのプレインキュベーションは、サイトカイン特異的SFCを完全に阻害しました。さらに、非関連性抗体の使用は斑点の形成をもたらさず、シクロヘキシミドによるマイトジェン活性化T細胞の治療は、IFN-GammaおよびIL-5特異的SFCの両方を阻害しました。IFN-GAMMまたはIL-5のいずれかを生成する個々のT細胞の検出を可能にする敏感な方法が開発されており、単一細胞レベルでのサイトカイン分泌の検出に役立つはずです。

Although several sensitive and specific assays have been developed to quantify murine cytokines, these assays do not allow individual cells to be correlated with the specific cytokines they produce. The purpose of this study was to develop a sensitive and reproducible method for the detection of individual T cells which secrete either interferon-gamma (IFN-gamma) or interleukin-5 (IL-5). We have used an adaptation of the enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay in which monoclonal antibodies to IFN-gamma (R4-6A2) and to IL-5 (TRFK-5) were used to coat 96-well plates with a nitrocellulose base. Mouse splenic T cells, either nonstimulated or activated with concanavalin A (ConA) or phytohemagglutinin (PHA), were cultured in individual wells. Following incubation, the cells were removed, and the bound cytokines probed with either biotinylated mAb anti-IFN-gamma (XMG 1.2) or anti-IL-5 (TRFK-4) followed by avidin-peroxidase. The spots which developed with 3-amino-9-ethylcarbazole were discrete and enumerated with a dissecting microscope. Although unstimulated splenic T cells contained low numbers of cytokine-specific spot-forming cells (SFC), 24-72 h activation with mitogen was required to induce significant numbers of cytokine producing cells. When mitogen-stimulated splenic CD4+ T cells were assessed, approximately equal numbers of IFN-gamma and IL-5 SFC were seen. Approximately 20-30% of all mitogen-activated splenic T cells produced at least one of these two cytokines. Pre-incubation of biotinylated anti-IFN-gamma with recombinant IFN-gamma (rIFN-gamma) or anti-IL-5 mAbs with rIL-5 completely inhibited cytokine-specific SFC. Further, use of nonrelevant antibodies did not result in spot formation, and treatment of mitogen-activated T cells with cycloheximide inhibited both IFN-gamma- and IL-5-specific SFC. A sensitive method has been developed which allows detection of individual T cells that produce either IFN-gamm or IL-5, and should be useful for detection of cytokine secretion at the single cell level.