Transfer-PCR（TPCR）：DNAクローニングとタンパク質工学のための高速道路

DNAクローニングとタンパク質エンジニアリングは、すべての生命科学分野でさまざまな用途に採用されている基本的な方法論です。ただし、DNAの操作は、その後の実験を遅くする長いプロセスである可能性があります。DNAクローニングとタンパク質エンジニアリングの両方を促進するために、単一のチューブに統合する新しいアプローチ、原点ベクトルからのターゲットDNAのPCR増幅、およびその後の宛先ベクトルへの統合を促進するために、Transfer-PCR（TPCR）を提示します。TPCRは、中間PCR産物の精製を必要とせず、市販のキットを使用せずに、円形プラスミド内の任意の任意の位置にDNAフラグメントを組み込むために適用できます。いくつかの例を使用して、DNAクローニングと複数サイトの標的変異誘発の両方にTPCRプラットフォームの適用性を示します。どちらの場合も、TPCR反応がプライマー濃度の狭い範囲内で最も効率的であることを示します。突然変異誘発では、TPCRは主に標的変異体の組み合わせライブラリの生成に有利ですが、標的遺伝子全体に特定の複数の変異を持つバリアントの生成にも適用できます。TPCRプラットフォームの適応は、多様なタンパク質構造と機能研究の時間とコストを促進、簡素化、および大幅に削減する必要があります。

DNA cloning and protein engineering are basic methodologies employed for various applications in all life-science disciplines. Manipulations of DNA however, could be a lengthy process that slows down subsequent experiments. To facilitate both DNA cloning and protein engineering, we present Transfer-PCR (TPCR), a novel approach that integrates in a single tube, PCR amplification of the target DNA from an origin vector and its subsequent integration into the destination vector. TPCR can be applied for incorporation of DNA fragments into any desired position within a circular plasmid without the need for purification of the intermediate PCR product and without the use of any commercial kit. Using several examples, we demonstrate the applicability of the TPCR platform for both DNA cloning and for multiple-site targeted mutagenesis. In both cases, we show that the TPCR reaction is most efficient within a narrow range of primer concentrations. In mutagenesis, TPCR is primarily advantageous for generation of combinatorial libraries of targeted mutants but could be also applied to generation of variants with specific multiple mutations throughout the target gene. Adaptation of the TPCR platform should facilitate, simplify and significantly reduce time and costs for diverse protein structure and functional studies.