分岐鎖α-ケトシドデヒドロゲナーゼ複合体のジヒドリポアミドデヒドロゲナーゼとサブユニット結合ドメインとの間の弱い相互作用の構造的および熱力学的基礎

精製された哺乳類分岐鎖α-ケトシドデヒドロゲナーゼ複合体（BCKDC）は、分岐鎖α-ケト酸の酸化的脱炭酸を触媒しているが、本質的には、成分のジヒドリポアミドデヒドロゲーゼ成分（E3）を欠いている（E3）。E3の欠如は、HE3のヒトBCKDC（HSBDB）のサブユニット結合ドメインの親和性が低いことに関連しています。この作業では、哺乳類のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のE3結合ドメイン（E3BD）とHSBDBの配列アラインメントは、HSBDBが118位にアルギニンを持っていることを示しています。ARG-118をアスパラギンに置換すると、HE3のR118N HSBDBバリアント（HSBDB*と指定されたHSBDB*）の結合親和性が約2桁増加します。結合反応のエンタルピーは、野生型HSBDBとの吸熱からHSBDB*バリアントとの発熱に変化します。このより高い親和性相互作用により、HE3/HSBDB*複合体の結晶構造が2.4Åの解像度に決定できました。構造は、Arg-118の存在が、野生型HSBDBとのE3の相互作用を妨げる可能性のあるユニークで、おそらく立体的および/または静電的互換性をもたらすことを示しました。E3/E3BD構造と比較して、HE3/HSBDB*構造は界面領域が小さくなっています。ソリューションNMRデータは、野生型HSBDBおよび変異HSBDB*におけるHE3とARG-118およびASN-118の相互作用をそれぞれ裏付けました。NMRの結果は、HSBDBとHE3の間の界面がHSBDBからHSBDB*に大幅に変化しないことも示しました。まとめると、我々の結果は、BCKDCのE2BコアがE3に他のα-ケトシドデヒドロゲナーゼ複合体と比較してはるかに弱く結合するという長年のエニグマを説明するための出発点を表しています。

The purified mammalian branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex (BCKDC), which catalyzes the oxidative decarboxylation of branched-chain α-keto acids, is essentially devoid of the constituent dihydrolipoamide dehydrogenase component (E3). The absence of E3 is associated with the low affinity of the subunit-binding domain of human BCKDC (hSBDb) for hE3. In this work, sequence alignments of hSBDb with the E3-binding domain (E3BD) of the mammalian pyruvate dehydrogenase complex show that hSBDb has an arginine at position 118, where E3BD features an asparagine. Substitution of Arg-118 with an asparagine increases the binding affinity of the R118N hSBDb variant (designated hSBDb*) for hE3 by nearly 2 orders of magnitude. The enthalpy of the binding reaction changes from endothermic with the wild-type hSBDb to exothermic with the hSBDb* variant. This higher affinity interaction allowed the determination of the crystal structure of the hE3/hSBDb* complex to 2.4-Å resolution. The structure showed that the presence of Arg-118 poses a unique, possibly steric and/or electrostatic incompatibility that could impede E3 interactions with the wild-type hSBDb. Compared with the E3/E3BD structure, the hE3/hSBDb* structure has a smaller interfacial area. Solution NMR data corroborated the interactions of hE3 with Arg-118 and Asn-118 in wild-type hSBDb and mutant hSBDb*, respectively. The NMR results also showed that the interface between hSBDb and hE3 does not change significantly from hSBDb to hSBDb*. Taken together, our results represent a starting point for explaining the long standing enigma that the E2b core of the BCKDC binds E3 far more weakly relative to other α-ketoacid dehydrogenase complexes.