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背景：私たちの以前の研究は、エタノールがアイソフォーム特異的な方法でアデニリルシクラーゼ（AC）の活性を高め、ACのアルコールカットオフポイントがアイソフォーム特異的であることを示しました。最近、2,3-ブタンジオールがAC型（AC7）活性を立体異性体特異的な方法で阻害し、この阻害もACアイソフォーム特異的であることを示しました。これらの観察結果は、キャンプシグナル伝達に対するアルコール作用の主要な標的がACであることを強く示唆しています。アルコールは、ACタンパク質と直接相互作用することにより、AC活性に対する影響を示すと仮定しました。しかし、無傷の細胞や膜調製などの過去の研究で採用された実験システムは複雑すぎて、この仮説を明確にテストすることはできません。膜結合ACのこれらの合併症のバイパスを試みるために、我々は細菌で発現するAC組換えタンパク質に対するアルコールの効果を研究することにしました。 方法：ヒトAC7のC（1A）およびC（2）ドメインからなるAC7SOLとして指定された組換えACは、細菌で設計および発現しました。AC7SOLの活性は、AC7SOLを発現する細菌から調製された溶解物を使用して調べました。 結果：AC7SOLの活性は、マンガンまたはAC（G（Sα））を刺激するGタンパク質のαサブユニットによって刺激されました。Forskolin自体はAC7SOLの活性を刺激しませんでした。しかし、活性化G（Sα）の存在下では、フォルスコリンはAC7SOLの活性を刺激しました。エタノールを含む一連のN-アルカノールは、AC7SOLのマンガン刺激活性を強化しました。AC7SOLのアルコールカットオフポイントはペンタノールでした。エタノールとブタノールは、AC7SOLのV（MAX）およびK（M）値を増加させました。 結論：これらの結果は私たちの仮説と一致しており、AC活性に対するアルコールの増加効果は、ACの離職数の増加によるものであることを示唆しています。現在の研究は、アルコールの効果がACのC（1A）およびC（2）ドメインのみを必要とし、ACの他のドメインや他の哺乳類タンパク質のドメインのみを必要とすることを初めて示しています。
背景：私たちの以前の研究は、エタノールがアイソフォーム特異的な方法でアデニリルシクラーゼ（AC）の活性を高め、ACのアルコールカットオフポイントがアイソフォーム特異的であることを示しました。最近、2,3-ブタンジオールがAC型（AC7）活性を立体異性体特異的な方法で阻害し、この阻害もACアイソフォーム特異的であることを示しました。これらの観察結果は、キャンプシグナル伝達に対するアルコール作用の主要な標的がACであることを強く示唆しています。アルコールは、ACタンパク質と直接相互作用することにより、AC活性に対する影響を示すと仮定しました。しかし、無傷の細胞や膜調製などの過去の研究で採用された実験システムは複雑すぎて、この仮説を明確にテストすることはできません。膜結合ACのこれらの合併症のバイパスを試みるために、我々は細菌で発現するAC組換えタンパク質に対するアルコールの効果を研究することにしました。 方法：ヒトAC7のC（1A）およびC（2）ドメインからなるAC7SOLとして指定された組換えACは、細菌で設計および発現しました。AC7SOLの活性は、AC7SOLを発現する細菌から調製された溶解物を使用して調べました。 結果：AC7SOLの活性は、マンガンまたはAC（G（Sα））を刺激するGタンパク質のαサブユニットによって刺激されました。Forskolin自体はAC7SOLの活性を刺激しませんでした。しかし、活性化G（Sα）の存在下では、フォルスコリンはAC7SOLの活性を刺激しました。エタノールを含む一連のN-アルカノールは、AC7SOLのマンガン刺激活性を強化しました。AC7SOLのアルコールカットオフポイントはペンタノールでした。エタノールとブタノールは、AC7SOLのV（MAX）およびK（M）値を増加させました。 結論：これらの結果は私たちの仮説と一致しており、AC活性に対するアルコールの増加効果は、ACの離職数の増加によるものであることを示唆しています。現在の研究は、アルコールの効果がACのC（1A）およびC（2）ドメインのみを必要とし、ACの他のドメインや他の哺乳類タンパク質のドメインのみを必要とすることを初めて示しています。
BACKGROUND: Our previous studies showed that ethanol enhanced the activity of adenylyl cyclase (AC) in an isoform-specific manner and that alcohol cutoff point of AC was isoform specific. Recently, we showed that 2,3-butanediol inhibited AC type 7 (AC7) activity in a stereoisomer-specific manner and that this inhibition was also AC isoform specific. These observations strongly suggest that a major target of alcohol action on cAMP signaling is AC. We hypothesized that alcohols exhibit their effect on AC activity by direct interaction with AC proteins. However, experimental systems employed in past studies such as intact cells and membrane preparations are too complex and do not allow us to unequivocally test this hypothesis. In attempt to bypass, these complications of the membrane-bound AC, we decided to study the effect of alcohols on AC recombinant proteins expressed in bacteria. METHODS: A recombinant AC, designated as AC7sol, consisting of the C(1a) and C(2) domains of the human AC7 was designed and expressed in bacteria. The activity of AC7sol was examined using lysate prepared from bacteria expressing AC7sol. RESULTS: The activity of AC7sol was stimulated by manganese or by the α subunit of G protein that stimulates AC (G(sα) ). Forskolin by itself did not stimulate the activity of AC7sol. However, in the presence of activated G(sα) , forskolin stimulated the activity of AC7sol. A series of n-alkanols including ethanol enhanced the manganese-stimulated activity of AC7sol. The alcohol cutoff point of AC7sol was pentanol. Ethanol and butanol increased V(max) and K(M) values of AC7sol. CONCLUSIONS: These results are consistent with our hypothesis and suggest that the enhancing effect of alcohols on AC activity is because of the increase in turnover number of AC. The current study demonstrates for the first time that the effect of alcohols requires only the C(1a) and C(2) domains of AC and no other domains of AC as well as no other mammalian proteins.
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