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適切な蛍光/クエンチャー（FL/Q）ペアを含むプロテアーゼ切断可能なペプチドは、標的プロテアーゼによって切断され、蛍光を生成するまで光学的に暗くなります。このアプローチは多くのFL/Qペアで使用されていますが、人気のある近赤外（NIR）フルーターであるIrdye 800CWではほとんど報告されていません。Azo-bondを含むブラックホールクエンチャー3（BHQ-3）の使用をIrdye 800cwのクエンチャーとして調査し、Irdye 800cw/BHQ-3は適切なスペクトルの重複がないにもかかわらず、適切なFL/Qペアであることを発見しました。蛍光共鳴エネルギー伝達（FRET）アプリケーション用。イルディー800CW-PLGLK（BHQ-3）AR-NH（2）（8）およびそのD-アルギニン（DARG）アナログ（9）の切断は、in vitroでマトリックスメタロタンパク酵素（MMP）によると、予想される切断断片を生成しました。生体内では、広範な代謝が見つかりました。「非切断可能な」コントロールIrdye 800CW-（1,13-ジアミノ-4,7,10-トリオキサトリデカン）-BHQ-3（10）の有意な分解は、注射後3分の正常マウスの血漿で明らかでした。主要な代謝物は、BHQ-3部分のAZO結合切断と一致するM/ZおよびUV/VISスペクトルを示しました。この代謝産物の本物の標準の準備（11）が割り当てを確認しました。Irdye 800CW/BHQ-3コンストラクトは、酵素切断前に効率的な接触消光を示しましたが、Azo結合の不安定性により、BHQ-3はin vivoで注意して使用する必要があります。
適切な蛍光/クエンチャー（FL/Q）ペアを含むプロテアーゼ切断可能なペプチドは、標的プロテアーゼによって切断され、蛍光を生成するまで光学的に暗くなります。このアプローチは多くのFL/Qペアで使用されていますが、人気のある近赤外（NIR）フルーターであるIrdye 800CWではほとんど報告されていません。Azo-bondを含むブラックホールクエンチャー3（BHQ-3）の使用をIrdye 800cwのクエンチャーとして調査し、Irdye 800cw/BHQ-3は適切なスペクトルの重複がないにもかかわらず、適切なFL/Qペアであることを発見しました。蛍光共鳴エネルギー伝達（FRET）アプリケーション用。イルディー800CW-PLGLK（BHQ-3）AR-NH（2）（8）およびそのD-アルギニン（DARG）アナログ（9）の切断は、in vitroでマトリックスメタロタンパク酵素（MMP）によると、予想される切断断片を生成しました。生体内では、広範な代謝が見つかりました。「非切断可能な」コントロールIrdye 800CW-（1,13-ジアミノ-4,7,10-トリオキサトリデカン）-BHQ-3（10）の有意な分解は、注射後3分の正常マウスの血漿で明らかでした。主要な代謝物は、BHQ-3部分のAZO結合切断と一致するM/ZおよびUV/VISスペクトルを示しました。この代謝産物の本物の標準の準備（11）が割り当てを確認しました。Irdye 800CW/BHQ-3コンストラクトは、酵素切断前に効率的な接触消光を示しましたが、Azo結合の不安定性により、BHQ-3はin vivoで注意して使用する必要があります。
Protease-cleavable peptides containing a suitable fluor/quencher (Fl/Q) pair are optically dark until cleaved by their target protease, generating fluorescence. This approach has been used with many Fl/Q pairs, but little has been reported with IRDye 800CW, a popular near-infrared (NIR) fluor. We explored the use of the azo-bond-containing Black Hole Quencher 3 (BHQ-3) as a quencher for IRDye 800CW and found that IRDye 800CW/BHQ-3 is a suitable Fl/Q pair, despite the lack of proper spectral overlap for fluorescence resonance energy transfer (FRET) applications. Cleavage of IRDye 800CW-PLGLK(BHQ-3)AR-NH(2) (8) and its D-arginine (Darg) analogue (9) by matrix metalloproteinases (MMPs) in vitro yielded the expected cleavage fragments. In vivo, extensive metabolism was found. Significant decomposition of a "non-cleavable" control IRDye 800CW-(1,13-diamino-4,7,10-trioxatridecane)-BHQ-3 (10) was evident in plasma of normal mice by 3 min post injection. The major metabolite showed a m/z and UV/vis spectrum consistent with azo bond cleavage in the BHQ-3 moiety. Preparation of an authentic standard of this metabolite (11) confirmed the assignment. Although the IRDye 800CW/BHQ-3 constructs showed efficient contact quenching prior to enzymatic cleavage, BHQ-3 should be used with caution in vivo, due to instability of its azo bond.
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