長時間のインキュベーションと積み重ねられたフィルム曝露は、ウエスタンブロッティングの感度を改善します

はじめに：ウエスタンブロッティングは、タンパク質検出のための基本的な手法です。品質が低い抗体または抗体の少ないタンパク質の場合、感度の増加が望まれます。より高い濃度の抗体と長時間のフィルム曝露時間がウエスタンブロットの感度を改善するのに役立つことは一般に知られていますが、両方の測定には独自のリスクが伴い、これらの測定値をどの程度適用すべきかはしばしば不明です。 方法：ウエスタンブロッティングにおけるタンパク質抗体相互作用と原発性抗体検査抗体相互作用を調査するための時間コース研究を実施しました。また、積み重ねられたフィルム曝露のプロトコルを提案し、標準曲線と癌細胞サンプルでテストしました。 結果：我々の研究では、タンパク質プライマリー抗体相互作用と原発性抗体抗体検度抗体相互作用には、一般的に「1時間」または「一晩」よりも長い時間がかかり、場合によっては48時間より長い時間がかかることがわかりました。また、積み重ねられたフィルム曝露の修正プロトコルは、標準曲線と生物学的サンプルの両方でうまく機能し、ターゲット信号をぼやけたり背景を増やしたりすることなく、ウエスタンブロットで最大の感度に達することを示しています。 議論：抗体濃度の定期的な最適化と膜曝露時間の最適化に加えて、抗体との長期インキュベーションと積み重ねられた膜曝露は、感度を改善し、ウエスタンブロットの背景を減らすのに役立ちます。

INTRODUCTION: Western blotting is a basic technique for protein detection. For proteins of less abundance or antibodies of poorer quality, an increased sensitivity is often desired. Although it is commonly known that higher concentrations of antibodies and prolonged film exposure times will help improve sensitivity in western blots, both measures come with their own risks, and it is often unclear to which extent these measures should be applied. METHODS: We conducted time-course studies to investigate protein-antibody interactions and primary antibody-secondary antibody interactions in western blotting. We also propose a protocol of stacked film exposure and have tested it in standard curves and cancer cell samples. RESULTS: Our study found that protein-primary antibody interactions and primary antibody-secondary antibody interactions could take a longer time than commonly used "one hour" or "overnight", and in some cases longer than 48h, to reach its maximum binding. We also show that the modified protocol of stacked film exposure works well for both standard curves and biological samples, reaching a maximum sensitivity in western blots without blurring target signals or increasing backgrounds. DISCUSSION: In addition to regular optimization of antibody concentrations and film exposure time, a prolonged incubation with antibodies and stacked film exposure will also help improve sensitivity and reduce background in western blotting.