二重変数型ドメイン免疫グロブリンの内側変数領域に対するリガンド関連率は、リンカーの設計により大きな影響を受けます

DVD-IG（TM）タンパク質は、二重特異的な免疫グロブリンです。分子の2つのアームのそれぞれには、2つの可変ドメイン、内側変数ドメインとタンデムにリンクされた外側変数ドメインが含まれ、それぞれが異なるターゲットまたはエピトープに対して結合特異性を備えています。進行中の研究の1つの領域では、外側変数ドメインの近接性が、リガンドの内部変数ドメインへの結合にどのように影響するかを決定することが含まれます。この領域を探索するために、TNFαと代替治療標的に結合特異性を備えた一連のDVD-IGタンパク質を準備しました。この一連のDVD-IGタンパク質へのTNFα結合の速度論的測定を使用して、リガンドのオンレートおよびオフレートに対する可変ドメイン位置とリンカー設計の効果をプローブしました。TNFαの親和性は、外部ドメインよりも内側のドメインに結合するときに一般に低く、この親和性の損失は主に関連率の低下によるものであることがわかりました。この効果は、リンカー設計によってある程度緩和される可能性があります。この一連のDVD-IGタンパク質で内部ドメインアフィニティ損失を軽減するいくつかのリンカー配列を示します。さらに、内側ドメインと外側ドメイン間の単一鎖タンパク質分解切断、または完全な外側ドメイン除去が、基準抗体に近づくものに対して内側のドメインTNFα親和性を大部分回復できることを示しています。まとめると、これらの結果は、このDVD-IGタンパク質のセットで内部変数ドメインに対する親和性の喪失が、主に単純な立体障害効果によって駆動され、慎重なリンカー設計によって減少する可能性があることを示唆しています。

The DVD-Ig (TM) protein is a dual-specific immunoglobulin. Each of the two arms of the molecule contains two variable domains, an inner variable domain and an outer variable domain linked in tandem, each with binding specificity for different targets or epitopes. One area of on-going research involves determining how the proximity of the outer variable domain affects the binding of ligands to the inner variable domain. To explore this area, we prepared a series of DVD-Ig proteins with binding specificities toward TNFα and an alternate therapeutic target. Kinetic measurements of TNFα binding to this series of DVD-Ig proteins were used to probe the effects of variable domain position and linker design on ligand on- and off-rates. We found that affinities for TNFα are generally lower when binding to the inner domain than to the outer domain and that this loss of affinity is primarily due to reduced association rate. This effect could be mitigated, to some degree, by linker design. We show several linker sequences that mitigate inner domain affinity losses in this series of DVD-Ig proteins. Moreover, we show that single chain proteolytic cleavage between the inner and outer domains, or complete outer domain removal, can largely restore inner domain TNFα affinity to that approaching the reference antibody. Taken together, these results suggest that a loss of affinity for inner variable domains in this set of DVD-Ig proteins may be largely driven by simple steric hindrance effects and can be reduced by careful linker design.