軽度の表現型を付与する天然フェニルアラニンヒドロキシラーゼバリアントは、酵素の立体構造の安定性とオリゴマー化平衡に影響します

ハイパーフェニルアラニン症は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（PAH）遺伝子の変異によって一般的に引き起こされる遺伝性疾患です。野生型PAH酵素は、その基質、補因子、およびリン酸化によって調節されるホモットターマーです。フルレングスの野生型タンパク質と7つの天然フルレングスPAHバリアント、P.I65M、P.N223Y、P.R297L、P.F382L、P.K398N、P.A403V、およびP.Q419Rを再現し、分析しました。彼らの生化学的および生物物理学的行動。すべての変異体は、野生型活性の38％から69％、つまり酵素活性の減少を示しました。生物物理学的特性評価は、サイズ排除クロマトグラフィー、光散乱、および循環二色性によって行われました。精製された野生型PAHでは、ダイマーと四量体との平衡状態のモノマーを特定しました。ほとんどの変異体では、平衡は二量体に向かってシフトし、ほとんどが凝集体を形成する傾向がありました。すべてのPAHバリアントは、二次構造の喪失と熱不安定化により、さまざまな生物物理学的行動を示しました。具体的には、P.F382Lは生理学的温度で非常に不安定でした。さらに、数と輝度技術を使用した共焦点顕微鏡を使用して、in vivoでのBH4応答性に関連する軽度の変異体である野生型PAHまたはP.A403Vを発現する生きたヒト細胞におけるBH4添加の効果を研究しました。我々の結果は、BH4の添加がオリゴマー化平衡の再確立を促進することを示しており、したがって、PA403Vの二量体からテトラマーへのシフトがBH4応答性に重要な役割を果たすことを示しています。結論として、オリゴマー化プロセスと立体構造の安定性は、酵素の生理学的挙動に影響を与える可能性のある変異によって変化することを示します。これは、特に軽度のヒト表現型に関して、HPAの最も一般的な原因であるPAH変異体のオリゴマー化と折り畳み欠陥がHPAの最も一般的な原因であるという仮説を支持します。

Hyperphenylalaninemias are genetic diseases prevalently caused by mutations in the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene. The wild-type PAH enzyme is a homotetramer regulated by its substrate, cofactor and phosphorylation. We reproduced a full-length wild-type protein and seven natural full-length PAH variants, p.I65M, p.N223Y, p.R297L, p.F382L, p.K398N, p.A403V, and p.Q419R, and analyzed their biochemical and biophysical behavior. All mutants exhibited reduced enzymatic activity, namely from 38% to 69% of wild-type activity. Biophysical characterization was performed by size-exclusion chromatography, light scattering and circular dichroism. In the purified wild-type PAH, we identified the monomer in equilibrium with the dimer and tetramer. In most mutants, the equilibrium shifted toward the dimer and most tended to form aggregates. All PAH variants displayed different biophysical behaviors due to loss of secondary structure and thermal destabilization. Specifically, p.F382L was highly unstable at physiological temperature. Moreover, using confocal microscopy with the number and brightness technique, we studied the effect of BH4 addition directly in living human cells expressing wild-type PAH or p.A403V, a mild mutant associated with BH4 responsiveness in vivo. Our results demonstrate that BH4 addition promotes re-establishment of the oligomerization equilibrium, thus indicating that the dimer-to-tetramer shift in pA403V plays a key role in BH4 responsiveness. In conclusion, we show that the oligomerization process and conformational stability are altered by mutations that could affect the physiological behavior of the enzyme. This endorses the hypothesis that oligomerization and folding defects of PAH variants are the most common causes of HPAs, particularly as regards mild human phenotypes.