蛍光共鳴エネルギー伝達ベースのセンサーCAMUIは、無傷の心筋細胞におけるカルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII活性化のメカニズムに関する新しい洞察を提供します

理論的根拠：カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CAMKII）は、心臓の細胞内シグナル伝達の重要なメディエーターです。ただし、現在、CAMKIIの局在化と生きている筋細胞の活性化における動的な変化を評価するために現在利用できるツールは限られています。 目的：私たちは、生きたウサギ筋細胞のCAMKII活性化状態を測定するために、CFPとYFPが隣接するフルレングスCAMKIIに隣接する新しいフレットベースのバイオセンサーであるCAMUIを使用します。 方法と結果：CAMKIIの自己リン酸化（T286A）および酸化調節（CM280/1VV）の部位を欠くCAMUIおよび変異体変異体が、CAMKIIδ活性化状態の有用なバイオセンサーとして機能することを示しています。CAMUI（野生型または変異体）は、分離された成体心筋細胞で発現し、共焦点顕微鏡を使用して局在化およびCAMKII活性化状態を決定しました。Camuiは、Camkiiδと同様に、ベースラインの活性化状態が低いZラインに濃縮されています。CAMUIの活性化はペーシング周波数とともに直接増加しましたが、最大効果はT286Aで鈍化し、主に高周波および高振幅CAトランジェントでのT286でのCAMKIIの周波数依存性リン酸化と一致しました。Camuiは、4つの神経ホルモンアゴニストによっても活性化されました。アンジオテンシンIIおよびエンドセリン-1は、主に酸化依存性メカニズムを介してカミュイを活性化しましたが、イソプロテレノールおよびフェニレフリン媒介メカニズムには有意な自己リン酸化依存性成分がありました。 結論：CAMUIは、生理学的に機能する筋細胞におけるCAMKII活性化状態の空間的に分解された測定を可能にする斬新で非破壊的なツールです。これは、CAMUIを使用して、ライブハートと筋細胞のCAMKIIシグナル伝達の重要な機械的詳細を解明するための最初のステップを表しています。

RATIONALE: Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) is a key mediator of intracellular signaling in the heart. However, the tools currently available for assessing dynamic changes in CaMKII localization and activation in living myocytes are limited. OBJECTIVE: We use Camui, a novel FRET-based biosensor in which full-length CaMKII is flanked by CFP and YFP, to measure CaMKII activation state in living rabbit myocytes. METHODS AND RESULTS: We show that Camui and mutant variants that lack the sites of CaMKII autophosphorylation (T286A) and oxidative regulation (CM280/1VV) serve as useful biosensors for CaMKIIδ activation state. Camui (wild-type or mutant) was expressed in isolated adult cardiac myocytes, and localization and CaMKII activation state were determined using confocal microscopy. Camui, like CaMKIIδ, is concentrated at the z-lines, with low baseline activation state. Camui activation increased directly with pacing frequency, but the maximal effect was blunted with the T286A, consistent with frequency-dependent phosphorylation of CaMKII at T286 mainly at high-frequency and high-amplitude Ca transients. Camui was also activated by 4 neurohormonal agonists. Angiotensin II and endothelin-1 activated Camui, largely through an oxidation-dependent mechanism, whereas isoproterenol- and phenylephrine-mediated mechanisms had a significant autophosphorylation-dependent component. CONCLUSIONS: Camui is a novel, nondestructive tool that allows spatiotemporally resolved measurement of CaMKII activation state in physiologically functioning myocytes. This represents a first step in using Camui to elucidate key mechanistic details of CaMKII signaling in live hearts and myocytes.