Phluorin2：強化された、比率、pH感受性の緑色蛍光タンパク質

pHの変化に敏感な緑色の蛍光タンパク質（GFP）バリアントは、内部およびエキソサイトーシスの両方の小胞輸送に関連するタンパク質ダイナミクスの分析のための非常に貴重な試薬です。レートメトリックフルオリンは、395および475 nmのピークと509 nmの発光を備えたバイモーダル励起スペクトルを表示するGFPバリアントです。酸性化すると、395 nmでのフルオーリン励起は、475 nmでの励起の対応する増加とともに減少します。GFP2は、哺乳類化コドンと折りたたみ促進変異F64Lを含むGFPバリアントであり、395 nmでの励起時のフルオリンと比較して、〜8倍高い蛍光を示します。GFP2をテンプレートとして使用して、強化されたレシオメトリックphluorin（phluorin2）コンストラクトが開発され、完全に哺乳類化されたコドン、F64L変異、および13のphluorin特異的変異の10個が含まれていました。その結果、Phluorin2は、レシオメトリックpH感受性を維持しながら、フルオリンと比較した場合、著しく高い蛍光を示します。ネイティブのフルオリンとは異なり、副甲状腺ホルモン1受容体のリガンド結合ドメインで発現したフルオリン2は、共焦点顕微鏡によって容易に検出でき、リガンド誘発性エンドサイトーシス時の蛍光の著しい増加を細胞内ベシクルに示します。したがって、レシオメトリックpH感受性を維持しながらPhluorin2の蛍光の強化は、この方法論的アプローチの大幅な改善を表しています。

Green florescent protein (GFP) variants that are sensitive to changes in pH are invaluable reagents for the analysis of protein dynamics associated with both endo- and exocytotic vesicular trafficking. Ratiometric pHluorin is a GFP variant that displays a bimodal excitation spectrum with peaks at 395 and 475 nm and an emission maximum at 509 nm. Upon acidification, pHluorin excitation at 395 nm decreases with a corresponding increase in the excitation at 475 nm. GFP2, a GFP variant that contains mammalianized codons and the folding enhancing mutation F64L, displays ~8-fold higher florescence compared to pHluorin upon excitation at 395 nm. Using GFP2 as a template, an enhanced ratiometric pHluorin (pHluorin2) construct was developed to contain fully mammalianized codons, the F64L mutation and ten of the thirteen pHluorin-specific mutations. As a result, pHluorin2 displays markedly higher florescence when compared to pHluorin while maintaining the ratiometric pH-sensitivity. Unlike native pHluorin, pHluorin2 expressed in the ligand-binding domain of the parathyroid hormone 1 receptor is readily detectable by confocal microscopy and displays a marked increase in florescence upon ligand-induced endocytosis to intracellular vesicles. Thus, pHluorin2's enhanced florescence while sustaining ratiometric pH-sensitivity represents a significant improvement for this methodological approach.