タンパク質膜オーバーレイアッセイ：in vitroで可溶性タンパク質と不溶性タンパク質間の相互作用をテストするプロトコル

異なるタンパク質間の相互作用の検証は、分子レベルでの生物学的機能の調査に不可欠です。タンパク質結合を評価するためのin vitroとin vivoの両方のいくつかの方法があり、信頼できる洞察を得るために互いの欠点を補完する少なくとも2つの方法を実施する必要があります。in vivoアッセイの場合、二分子蛍光補完（BIFC）アッセイは、生細胞内のタンパク質間相互作用を検出し、相互作用するタンパク質の細胞内局在を特定できる最も一般的で最も侵襲的なアプローチを表します。このアッセイでは、GFPまたはその変異体の非蛍光NおよびC末端半分は、テスト済みタンパク質に融合され、テスト済みタンパク質の相互作用のために2つの融合タンパク質がまとめられた場合、蛍光シグナルが再構成されます。そのシグナルは、脂肪症または共焦点顕微鏡によって容易に検出可能であるため、BIFCは、生細胞におけるタンパク質間相互作用について研究するための細胞生物学者の間で選択の強力なツールとして浮上しています。ただし、このアッセイでは、誤った陽性の結果が生じる場合があります。たとえば、蛍光信号は、特定の相互作用のために、小さな細胞内コンパートメントでの密接な梱包により、互いに7 nmに配置された2つのGFPフラグメントによって再構成できます。これらの制限により、ライブセルイメージングテクノロジーから得られた結果は、タンパク質相互作用を検出するための異なる原則に基づく独立したアプローチによって確認されるべきです。共免疫沈降（Co-IP）またはグルタチオントランスフェラーゼ（GST）プルダウンアッセイは、in vitroでタンパク質間相互作用を分析するために一般的に使用されるこのような代替方法を表しています。ただし、これらのアッセイでは、テストされたタンパク質は、結合反応をサポートするバッファーに容易に溶けている必要があります。したがって、不溶性タンパク質を含む特定の相互作用は、これらの技術によって評価することはできません。ここでは、この困難を回避するタンパク質膜オーバーレイ結合アッセイのプロトコルを示します。この手法では、タンパク質の1つが膜マトリックスに固定されているため、可溶性タンパク質と不溶性タンパク質の相互作用を確実にテストできます。この方法は、BIFCなどのin vivo実験と組み合わせて、可溶性タンパク質と不溶性タンパク質の間で相互作用を忠実に調査および特徴付ける信頼できるアプローチを提供します。この記事では、ウイルス細胞から細胞への輸送中に複数の機能を発揮するタバコモザイクウイルス（TMV）運動タンパク質（MP）と最近同定された植物細胞相互作用因子であるタバコアンキリン反復タンパク質（ANK）の間の結合とこの手法を使用して実証されています。

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins' interactions, the fluorescent signal is reconstituted. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions. Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques. Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK), is demonstrated using this technique.