内部ミトコンドリア膜におけるこの電子伝達複合体の[35S]ジアゾベンゼンスルホネート方向によるシトクロムCオキシダーゼの標識

分離されたシトクロムCオキシダーゼは、Triton X-100のネイティブゲル電気泳動によって分画され、通常の不純物を含まない酵素の調製が回収されました。この画分は、シトクロムCオキシダーゼに特異的な抗体を生成するために使用されました。これらの抗体は、シトクロムCオキシダーゼ活性を迅速かつ完全に完全に阻害し、界面活性剤溶解したミトコンドリアまたは提出軟骨粒子から7つの異なるサブユニットを含む酵素を免疫沈降させました。[35S]ジアゾベンゼンスルホネートとの洗剤溶解シトクロムCオキシダーゼと7つのサブユニットすべてと標識された反応は、他の5つの成分よりもはるかに反応性が低かった。シトクロムCオキシダーゼが[35S]ダブと反応されたミトコンドリアから免疫沈降したとき、サブユニットIIおよびIIIは標識唯一の成分でした。複合体が標識された提出導体粒子から免疫沈降されたとき、II、III、IV、V、およびVIIのすべて標識されました。ポリペプチドIおよびVIは、膜の両側から標識されていませんでした。これらの結果は、シトクロムCオキシダーゼがミトコンドリアの内膜に及ぼし、この透過性の障壁に非対称に配置されていることを示した以前の研究を裏付けています。

Isolated cytochrome c oxidase was fractionated by native-gel electrophoresis in Triton X-100, and a preparation of enzyme almost completely free of the usual impurities was recovered. This fraction was used to generate antibodies specific to cytochrome c oxidase. These antibodies inhibited cytochrome c oxidase activity rapidly and completely and immunoprecipitated an enzyme containing seven different subunits from detergent-solubilized mitochondria or submitochondrial particles. Reaction of detergent-solubilized cytochrome c oxidase with [35S]diazobenzenesulfonate labeled all seven subunits although I and VI were much less reactive than the other five components. When cytochrome c oxidase was immunoprecipitated from mitochondria which had been reacted with [35S]DABS, subunits II and III were the only components labeled. When the complex was immunoprecipitated from labeled submitochondrial particles, II, III, IV, V, and VII were all labeled. Polypeptides I and VI were not labeled from either side of the membrane. These results confirm earlier studies which showed that cytochrome c oxidase spans the mitochondrial inner membrane and is asymmetrically arranged across this permeability barrier.