神経再生研究へのプロテオミクスの応用

末梢神経損傷は臨床上および公衆衛生上の大きな課題です。戦時中に一般的かつますます蔓延している症状ですが (1)、末梢神経、神経叢、歯根の損傷は民間の外傷センターで診察される患者の 5% に存在します (2)。ある研究によると、外傷センターにおける末梢神経損傷のほぼ半数は自動車事故によるもので、約半数は手術が必要でした(3)。末梢神経損傷は、機能喪失や、転倒、骨折、その他の損傷による二次障害のリスク増加を通じて、生活の質に大きな影響を与える可能性があります(2)。ニューロンは、感覚ニューロンの末梢受容体から中枢神経系（脳および脊髄）に感覚情報を伝え、また中枢神経系からの指令を神経支配されている骨格筋などの効果器に伝えるために、発生中に確立された複雑な通信ネットワークで接続されています。運動ニューロンによって。末梢神経環境は非常に複雑で、ニューロンからの軸索突起、シュワン細胞や線維芽細胞などの支持細胞、および神経への血液供給から構成されます。神経内膜として知られる結合組織が末梢神経軸索を取り囲んでいます。末梢神経内では、軸索は神経周膜として知られる結合組織に囲まれた束にグループ化されます。束のグループの間および周囲には神経上膜があります。微小血管叢は神経上膜を縦方向に進み、神経周膜を通って枝を送り、神経内膜に毛細血管の血管網を形成します (4)。末梢神経の主な支持細胞はシュワン細胞です。シュワン細胞は軸索の周りをらせん状に何度も包み込み、その原形質膜がミエリン鞘または神経鞘として知られる軸索の周囲に脂質に富んだ管状のカバーを形成します。シュワン細胞とミエリン鞘は軸索を支持および維持し、神経損傷後の軸索再生中に軸索を誘導するのに役立ちます(5)。再生中の軸索は、遠位神経断端に残っている基底板管の内側部分、よく特徴づけられた「バングナー帯」に沿って成長することを強く好むことは、かなり前から知られていました(6-10)。もともと有髄軸索と結合していたシュワン細胞は、切断部位から遠位端の器官標的に至るまでずっとこのようなバンドを形成します。ここで重要な概念は、再生中の軸索の最終的な遠位の目的地は、神経切断部位に進入するシュワン細胞管によって主に決定されるということである(9、11、12)。軸索内に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いた最近の精緻な研究により、圧挫または切断損傷のいずれかより遠位にある再生軸索のほとんど（すべてではない）が、遠位神経断端内で成長する際に単一のシュワン細胞バンド内に留まることが確認された（13、 14)。運動系内では、同じ軸索が主に同じ神経筋接合部を再神経支配し、シュワン細胞帯が軸索の伸長を指示するための機械的障壁として機能することさえ示されている(13)。神経細胞体は、細胞内の実質的にすべてのタンパク質と細胞小器官の合成部位です。順行性輸送として知られる複雑なプロセスは、物質を神経細胞体から軸索を介して末端シナプスまで連続的に移動させます。これらの輸送物質には、シナプス間隙 (5) または筋肉の運動ニューロン神経支配の場合のように神経筋接合部 (15) として知られる狭い細胞外空間を介して、ニューロンと末端器官組織の間の伝達を促進する神経伝達物質が含まれます。逆に、筋肉などの末端器官は、神経成長因子として機能する物質を生成します。これらは神経筋接合部を通って神経支配運動ニューロン軸索に到達します(16)。これらの物質、またはそれらによって誘導される化学メッセンジャーの一部はパッケージ化され、逆行性輸送によってシナプスから軸索を介して神経細胞体に運ばれます。このようにして、ニューロンとその末端器官は、それらの間の接続の状態について継続的に情報を得ることができます。末端器官からの情報は、既存の神経細胞の接続を維持し、損傷した神経細胞の再生を促進する因子の形をとることが示唆されています。例えば、筋肉が運動ニューロンの発達と再生に強い影響を与えることは以前から知られており、我々は最近、個々の筋肉の中にさえ再神経支配の精度に影響を与える可能性のある要因があることを示しました(17)。最近の研究は、単一の筋線維が選択的に損傷を受けると、神経筋接合部の近位側を構成する運動ニューロン軸索終末が急速に萎縮し、数時間以内に筋シナプス後部位から引っ込むことを見事に示した(18)。末梢神経損傷の臨床的意義、予後、治療は損傷の部位と程度によって異なります。再生にもかかわらず、広範な末梢神経損傷は、四肢全体または四肢の遠位部分の実質的な麻痺を引き起こす可能性があります。 2 つの末梢神経損傷分類スキーム、Seddon (19) と Sunderland (20) が一般的に使用されています。これらは、損傷が脱髄のみに限定されているか、軸索および支持結合組織のより重篤な破壊であるかに応じて、神経損傷を分類します。セドン氏によると、最も重篤な損傷は軸索断裂と神経断裂に分類されるという。軸索切断は、結合組織フレームワークの破壊ではなく軸索破壊を特徴とする神経損傷です。結合組織とシュワン管は比較的無傷です。これは、転倒や自動車事故でよく見られる伸展損傷の典型です。対照的に、神経切断には、神経幹と結合組織構造の破壊が含まれます。これは、神経が完全に切断されたり、ひどく潰されたりした損傷で発生します。神経内膜シュワン細胞管が無傷のままである末梢神経損傷の予後は良好です。シュワン細胞管が破壊されると、再生軸索がたどる確立された経路が失われます。広範囲の損傷の場合は、通常、損傷した神経組織を除去し、直接吻合または神経組織移植によって生存可能な神経末端を結合する手術が必要です(1)。手術用顕微鏡と微細縫合糸の導入を含む顕微手術技術の改良により、この機械的プロセスの精度は向上しましたが、最先端の現在の技術を使用して正常な神経機能を回復できるのは成人のわずか 10% だけです (21-23)。顕微手術技術は限界に達しています。最細の縫合糸材料と針 (それぞれミクロン) が、修復する必要がある最小の軸索よりもかなり大きいことを考えると、これは驚くべきことではありません。末梢神経損傷後の機能回復の主な鍵は、軸索を元の標的末端器官まで正確に再生することです。臨床神経修復の著名なリーダーはかつてこう述べました、「問題の核心は軸索の再生を促進することではなく、軸索を本来あるべき場所に戻すことにある」(Sunderland、1991)(23)。運動軸索と感覚軸索が混在する混合末梢神経のレベルでは、損傷部位における適切な末端神経枝の正しい識別選択が、その後の適切な末端器官標的への再神経支配の成功に必要な前提条件となる。以前に筋肉を神経支配していた運動軸索は感覚器官に誤って誘導される可能性があり、通常皮膚を神経支配する感覚軸索は筋肉に誤って誘導される可能性があります。誤った方向に再生が行われると、機能回復の大きな障害となります。軸索の再生と、軸索が標的組織に移動するために使用するメカニズムを理解するために、私たちの研究室は一連の研究を実施しており、現在、正確な軸索の再生を指示する根本的なメカニズムである可能性のある特定の生化学メディエーターを同定するためのプロテオミクス研究で最高潮に達しています。げっ歯類の大腿神経における軸索再生モデルの開発における私たちと他の人の研究、およびそこから学んだことについて説明します。次に、二次元微分ゲル電気泳動 (2D-DIGE) や質量分析などのプロテオミクスのアプローチを、末梢神経損傷の新しい治療法につながる可能性のある根底にあるメディエーターを特定するためにどのように使用できるかを示す、現在の研究の方向性を示します。

Peripheral nerve injury is a major clinical and public health challenge. Although a common and increasingly prevalent wartime condition (1), injury to peripheral nerves, plexuses, and roots is present in 5% of patients seen in civilian trauma centers (2). In one study, almost half of peripheral nerve injuries at trauma centers were due to motor vehicle accidents and about half required surgery (3). Peripheral nerve injuries can substantially impact quality of life through loss of function and increased risk of secondary disabilities from falls, fractures, and other injuries (2). Neurons are connected in intricate communication networks established during development to convey sensory information from peripheral receptors of sensory neurons to the central nervous system (the brain and spinal cord), and to convey commands from the central nervous system to effector organs such as skeletal muscle innervated by motor neurons. The peripheral nerve environment is quite complex, consisting of axonal projections from neurons, supporting cells such as Schwann cells and fibroblasts, and the blood supply to the nerve. Connective tissue known as endoneurium surrounds peripheral nerve axons. Within peripheral nerves, axons are grouped into fascicles surrounded by connective tissue known as perineurium. Between and surrounding groups of fascicles is the epineurium. Microvessel plexuses course longitudinally through the epineurium and send branches through the perineurium to form a vascular network of capillaries in the endoneurium (4). The primary supporting cell for peripheral nerves is the Schwann cell. Schwann cells wrap around axons in a spiral fashion multiple times and their plasma membranes form a lipid-rich tubular cover around the axon known as the myelin sheath or the neurilemma. Schwann cells and the myelin sheath support and maintain axons and help to guide axons during axonal regeneration following nerve injury (5). It has been known for quite some time that regenerating axons exhibit a strong preference for growing along the inside portion of remaining basal lamina tubes in the distal nerve stump, the well-characterized “bands of Bungner” (6–10). Schwann cells originally associated with myelinated axons form such bands all the way from the transection site to the distal end organ target. The critical concept here is that the eventual distal destination of regenerating axons is largely determined by the Schwann cell tubes as they enter at the nerve transection site (9,11,12). Recent elegant work with transgenic mice expressing fluorescent proteins in their axons has verified that most (but not all) regenerating axons distal to either a crush or a transection injury remain within a single Schwann cell band as they grow within the distal nerve stump (13,14). Within the motor system it has even been shown that the same axon predominantly reinnervates the same neuromuscular junctions, and that Schwann cell bands act as mechanical barriers to direct axon outgrowth (13). The neuronal cell body is the site of synthesis of virtually all proteins and organelles in the cell. A complex process known as anterograde transport continuously moves materials from the neuronal cell body via the axon to its terminal synapse. These transported substances include neurotransmitters that facilitate communications between the neuron and end organ tissue across a narrow extracellular space known as the synaptic cleft (5) or, as in the case of the motor neuron innervation of muscle, the neuromuscular junction (15). Conversely, end organs such as muscle produce substances that act as nerve growth factors. These make their way across the neuromuscular junction to the innervating motor neuron axon (16). Some of these substances, or chemical messengers induced by them, are packaged and conveyed by retrograde transport from the synapse via the axon to the neuronal cell body. In this manner, the neuron and its end organ are continuously informed about the status of the connection between them. It has been suggested that information from end organs takes the form of factors that sustain existing nerve cell connections and promote the regeneration of damaged nerve cells. For instance, it has long been known that muscle exerts a strong influence on developing and regenerating motor neurons, and we have recently shown that even within an individual muscle there are factors that can influence the accuracy of reinnervation (17). Recent work has elegantly shown that if a single muscle fiber is selectively lesioned, the motor neuron axon terminal making up the proximal side of the neuromuscular junction rapidly atrophies and withdraws from the muscle postsynaptic sites within a matter of hours (18). The clinical significance, prognosis, and treatment of peripheral nerve injury depend on the site and extent of the injury. Despite regeneration, extensive peripheral nerve injuries can result in the effective paralysis of the entire limb or distal portions of the limb. Two peripheral nerve injury classification schemes, the Seddon (19) and the Sunderland (20), are in common use. These classify nerve injury according to whether the injury was confined to demyelination only or a more severe disruption of axons and supporting connective tissue. According to Seddon, the most severe injuries are classified as axonotmesis and neurotmesis. Axonotmesis is a nerve injury characterized by axon disruption rather than destruction of the connective tissue framework. The connective tissue and Schwann tubes are relatively intact. This is typical of stretch injuries common in falls and motor vehicle accidents. In contrast, neurotmesis involves the disruption of the nerve trunk and the connective tissue structure. This would occur in injuries where the nerve has been completely severed or badly crushed. Prognosis is good in peripheral nerve injuries where endoneurial Schwann cell tubes remain intact. Disruption of the Schwann cell tubes results in the loss of established pathways that regenerating axons follow. For extensive injuries, surgery is usually necessary to remove damaged nerve tissue and join viable nerve ends by direct anastomosis or by a nerve tissue graft (1). Refinement of microsurgical techniques involving the introduction of the surgical microscope and microsutures has increased the accuracy of this mechanical process, yet only 10% of adults will recover normal nerve function using state-of-the-art current techniques (21–23). The limits of microsurgical techniques have been reached; this is not surprising given that the finest suture material and needles ( and microns, respectively) are still quite a bit larger than the smallest axons that need to be repaired. The major key to recovery of function following peripheral nerve lesions is the accurate regeneration of axons to their original target end organs. A recognized leader of clinical nerve repair once stated, “The core of the problem is not promoting axon regeneration, but in getting them back to where they belong” (Sunderland, 1991) (23). At the level of a mixed peripheral nerve where motor and sensory axons are intermixed, correct discriminatory choices for appropriate terminal nerve branches at the lesion site are necessary prerequisites for the subsequent successful reinnervation of appropriate end-organ targets. Motor axons previously innervating muscle may be misdirected to sensory organs, and sensory axons typically innervating skin can be misdirected to muscle. Misdirected regeneration is a major barrier to functional recovery. In order to understand axonal regeneration and the mechanisms that axons use to navigate to target tissues, our laboratory has conducted a series of studies that are now culminating in proteomic investigations to identify specific biochemical mediators that may be the underlying mechanisms that direct accurate axon regeneration. We describe our work and that of others in the development of a model of axonal regeneration in the rodent femoral nerve and what we have learned from it. Then we will lay out our current research direction illustrating how approaches in proteomics such as two-dimensional differential gel electrophoresis (2D-DIGE) and mass spectrometry can be used to identify the underlying mediators that may lead to new therapies for peripheral nerve injury.