重合酵母酵母αβ-チューブリン変異体の設計、過剰発現、および精製

微小管ダイナミクスは、細胞内組織と細胞分裂に重要な役割を果たします。それらは、αβ-チューブリンヘテロダイマーの構造的および生化学的特性と、これらの重合サブユニットが自分自身および調節タンパク質とどのように相互作用するかに起因します。基礎となるメカニズムの幅広い理解が確立されていますが、基本的な問題は未解決のままです。組換えαβ-チューブリンへの日常的なアクセスの欠如は、αβ-チューブリン構造、生化学、および認識に対するより深い洞察に対する障害を表しています。実際、動物の脳αβ-チューブリンへの広範な依存は、サイト指向の突然変異誘発のような強力で通常の日常的な技術を利用したin vitroの研究がほとんどないことを意味します。ここでは、Saccharomyces cerevisiaeの誘導性のある過剰発現株から野生型または変異酵母αβ-チューブリンを精製するための新しい方法を報告します。誘導性過剰発現は、構成的表現に依存する既存のアプローチに対する改善です。また、より高い収率を提供しながら、そうでなければ致死的な変異体を精製することもできます。また、重合遮断されたαβ-チューブリン変異体を設計および精製しました。これらのαβ-チューブリンの「ブロックされた」形態は、細胞で発現すると支配的な致死表現型を与えます。それらはin vitroで微小管を形成することはできず、混合物に存在する場合、野生型αβ-チューブリンの重合を阻害します。精製された変異体は正常な流体力学的特性を示し、GTPに結合し、チューブリン結合ドメインと相互作用するため、ブロッキング変異の影響は非常に特異的です。野生型αβ-チューブリン、またはここで報告するような変異体を過剰発現および精製する能力は、αβ-チューブリンの構造研究と調節タンパク質を含むその複合体、および微小管ダイナミクスとその生化学的および機能的研究の新しい機会を生み出します。規制。

Microtubule dynamics play essential roles in intracellular organization and cell division. They result from structural and biochemical properties of αβ-tubulin heterodimers and how these polymerizing subunits interact with themselves and with regulatory proteins. A broad understanding of the underlying mechanisms has been established, but fundamental questions remain unresolved. The lack of routine access to recombinant αβ-tubulin represents an obstacle to deeper insight into αβ-tubulin structure, biochemistry, and recognition. Indeed, the widespread reliance on animal brain αβ-tubulin means that very few in vitro studies have taken advantage of powerful and ordinarily routine techniques like site-directed mutagenesis. Here we report new methods for purifying wild-type or mutant yeast αβ-tubulin from inducibly overexpressing strains of Saccharomyces cerevisiae. Inducible overexpression is an improvement over existing approaches that rely on constitutive expression: it provides higher yields while also allowing otherwise lethal mutants to be purified. We also designed and purified polymerization-blocked αβ-tubulin mutants. These "blocked" forms of αβ-tubulin give a dominant lethal phenotype when expressed in cells; they cannot form microtubules in vitro and when present in mixtures inhibit the polymerization of wild-type αβ-tubulin. The effects of blocking mutations are very specific, because purified mutants exhibit normal hydrodynamic properties, bind GTP, and interact with a tubulin-binding domain. The ability to overexpress and purify wild-type αβ-tubulin, or mutants like the ones we report here, creates new opportunities for structural studies of αβ-tubulin and its complexes with regulatory proteins, and for biochemical and functional studies of microtubule dynamics and its regulation.