D-2-ヒドロキシグルタル酸尿症におけるIDH2機能獲得活性のためのリンパ芽球モデルタイプII：生化学的および治療研究のための新しい手段

d-hydroxyglutar酸化酸酸酸酸薬酸リタル酸酸酸薬酸酸薬薬酸薬刺要刺激薬会社深化（140）またはGln（140）（140）（IDH2（WT/R140G））からGLN（140）またはGLN（140）（IDH2（WT/R140G））からGLN（140）またはGLN（140）（140）（140）（140）（140）またはGln（140）またはGln（140）（140）またはGln（140）からのヘテロ接合性等社会的デヒドロゲナーゼ2（IDH2）変異の最近の発見（D-2-HGA）は、D-2-HGA患者の50％で主要な遺伝的病変を定義しました。これは、II型を示しています。IDH1（R132H）およびIDH2（R172K）変異を用いた過剰発現研究により、酵素が新しい機能を獲得し、2-ケトグルタル酸（2 kg）をD-2-ヒドロキシグルタル酸（D-2-HG）に通常のd-2-ヒドロキシグルタル酸（D-2-HG）に変換したことが示されました。等社会的に2 kgに変換するIDH反応。D-2-HGAタイプIIのIDH2（WT/R140Q）機能の獲得を確認し、潜在的な治療戦略を評価するために、リンパ芽球の特異的で敏感なIDH2（WT/R140Q）酵素アッセイを開発しました。このアッセイは、D-2-HGA型リンパ芽球のホモジネートで2 kgをD-2-HGに変換し、安定したアイソトープ標識2-ケトを使用する機能獲得活性を決定します[3,3,4,4,4 - （2）H（4）]グルタレート。アッセイの特異性と感度は、カイラル分離と、超パフォーマンス液体クロマトグラフィータンデム質量分析（UPLC-MS/MS）による安定したアイソトープ標識D-2-Hgの検出により強化されます。IDH2（WT/R140Q）酵素活性の11の潜在的阻害剤をこの手順で評価しました。D-2-HGAタイプIIリンパ芽球の平均反応速度は、コントロールおよびD-2-HGA型I型細胞（14.4Nmolh（-1）mgタンパク質（-1）対1.9）の平均反応速度よりも8倍高かった。細胞内D-2-HGレベルの対応する140倍の増加。IDH2（WT/R140Q）活性の最適な阻害は、オキサロ酢酸を使用して得られ、IDH2（WT/R140Q）活性を競合的に阻害しました。リンパ芽球IDH2（WT/R140Q）は、ヘテロ接合IDH2（WT/R140Q）変異を失うことなく長期の細胞培養安定性を示し、将来の生化学的および治療研究のためのリンパ芽細胞モデルの有用性を強調しました。

The recent discovery of heterozygous isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) mutations of residue Arg(140) to Gln(140) or Gly(140) (IDH2(wt/R140Q), IDH2(wt/R140G)) in d-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) has defined the primary genetic lesion in 50% of D-2-HGA patients, denoted type II. Overexpression studies with IDH1(R132H) and IDH2(R172K) mutations demonstrated that the enzymes acquired a new function, converting 2-ketoglutarate (2-KG) to d-2-hydroxyglutarate (D-2-HG), in lieu of the normal IDH reaction which reversibly converts isocitrate to 2-KG. To confirm the IDH2(wt/R140Q) gain-of-function in D-2-HGA type II, and to evaluate potential therapeutic strategies, we developed a specific and sensitive IDH2(wt/R140Q) enzyme assay in lymphoblasts. This assay determines gain-of-function activity which converts 2-KG to D-2-HG in homogenates of D-2-HGA type II lymphoblasts, and uses stable-isotope-labeled 2-keto[3,3,4,4-(2)H(4)]glutarate. The specificity and sensitivity of the assay are enhanced with chiral separation and detection of stable-isotope-labeled D-2-HG by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Eleven potential inhibitors of IDH2(wt/R140Q) enzyme activity were evaluated with this procedure. The mean reaction rate in D-2-HGA type II lymphoblasts was 8-fold higher than that of controls and D-2-HGA type I cells (14.4nmolh(-1)mgprotein(-1) vs. 1.9), with a corresponding 140-fold increase in intracellular D-2-HG level. Optimal inhibition of IDH2(wt/R140Q) activity was obtained with oxaloacetate, which competitively inhibited IDH2(wt/R140Q) activity. Lymphoblast IDH2(wt/R140Q) showed long-term cell culture stability without loss of the heterozygous IDH2(wt/R140Q) mutation, underscoring the utility of the lymphoblast model for future biochemical and therapeutic studies.