ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γリガンドのアロステリックバイオセンサータンパク質の工学と最適化

ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（PPARγまたはPPARG）は、核内受容体のスーパーファミリーに属し、さまざまな疾患の潜在的な薬物標的です。この作業では、機能的なPPARγリガンドを同定するための一連の細菌バイオセンサーを構築しました。これらのセンサーは、PPARγリガンド結合ドメイン（LBD）、工学的ミニインテインドメイン、大腸菌マルトース結合タンパク質（MBD）、およびAチミジル酸シンターゼ酵素（TS）レポーターENzymeで構成される4ドメイン融合タンパク質を運ぶ修飾された大腸菌細胞を伴います。このタンパク質を発現する大腸菌細胞は、ホルモンリガンド依存性成長表現型を示します。公開されたエストロゲン（ER）および甲状腺受容体（TR）バイオセンサーとは異なり、標準的なPPARγバイオセンサー細胞は、リガンドの非存在下で顕著な成長を示しました。しかし、彼らはアゴニストがいなくてもアゴニストと拮抗薬を区別することができました。このセンサーのリガンド感度を改善するために、PPARγLBD挿入点に隣接するリンカーペプチドを設計および最適化しようとしました。元のリンカーの切り捨てにより、基底成長が低下し、PPARγセンサーのリガンド感度が大幅に向上し、最適化されたG（4）s（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）リンカーにネイティブリンカーを置換しても感度が増加しました。私たちの研究は、リンカー、特にC末端リンカーの特性が、リガンド結合によって誘発されるアロステリック信号の効率と忠実度に大きく影響することを示しています。私たちの研究はまた、機能性LBDの修正なしに、このマルチドメインセンサータンパク質のアロステリック挙動を増加させるアプローチを示唆しています。

The peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ or PPARG) belongs to the nuclear receptor superfamily, and is a potential drug target for a variety of diseases. In this work, we constructed a series of bacterial biosensors for the identification of functional PPARγ ligands. These sensors entail modified Escherichia coli cells carrying a four-domain fusion protein, comprised of the PPARγ ligand binding domain (LBD), an engineered mini-intein domain, the E. coli maltose binding protein (MBD), and a thymidylate synthase (TS) reporter enzyme. E. coli cells expressing this protein exhibit hormone ligand-dependent growth phenotypes. Unlike our published estrogen (ER) and thyroid receptor (TR) biosensors, the canonical PPARγ biosensor cells displayed pronounced growth in the absence of ligand. They were able to distinguish agonists and antagonists, however, even in the absence of agonist. To improve ligand sensitivity of this sensor, we attempted to engineer and optimize linker peptides flanking the PPARγ LBD insertion point. Truncation of the original linkers led to decreased basal growth and significantly enhanced ligand sensitivity of the PPARγ sensor, while substitution of the native linkers with optimized G(4)S (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) linkers further increased the sensitivity. Our studies demonstrate that the properties of linkers, especially the C-terminal linker, greatly influence the efficiency and fidelity of the allosteric signal induced by ligand binding. Our work also suggests an approach to increase allosteric behavior in this multidomain sensor protein, without modification of the functional LBD.