FKBP-MTOR融合タンパク質、DSC、およびNMRの組み合わせを使用したFKBP12依存性および非依存性MTOR阻害剤の評価ツール

大きなマルチドメイン プロテイン キナーゼである哺乳類ラパマイシン標的 (mTOR) は、環境シグナルに応答して細胞の成長と代謝を制御します。mTOR の FKBP ラパマイシン結合 (FRB) ドメインは、免疫抑制剤および抗がん剤開発の有効な治療標的ですが、不安定で不溶性です。ここで我々は、FKBP12とmTORのFRBドメインとの間の融合タンパク質を設計した。この融合タンパク質は大腸菌内で可溶型として発現することに成功し、簡単な 2 段階のクロマトグラフィー手順で精製されました。この融合タンパク質は、単離された FRB ドメインと比較して溶解性と安定性が向上しており、示差走査熱量測定 (DSC) および溶液核磁気共鳴 (NMR) を使用したラパマイシンと FK506 の結合の分析が容易になりました。DSC によりドメイン レベルでのタンパク質と薬物の相互作用を迅速に観察できるようになり、NMR により残基レベルでのタンパク質と薬物の相互作用についての洞察が得られました。FKBP12-FRB 融合タンパク質を DSC および NMR と組み合わせて使用すると、FKBP12 依存性および非依存性の mTOR FRB ドメイン阻害剤を効率的にスクリーニングするための有用なツールが提供されます。

Mammalian target of rapamycin (mTOR), a large multidomain protein kinase, regulates cell growth and metabolism in response to environmental signals. The FKBP rapamycin-binding (FRB) domain of mTOR is a validated therapeutic target for the development of immunosuppressant and anticancer drugs but is labile and insoluble. Here we designed a fusion protein between FKBP12 and the FRB domain of mTOR. The fusion protein was successfully expressed in Escherichia coli as a soluble form, and was purified by a simple two-step chromatographic procedure. The fusion protein exhibited increased solubility and stability compared with the isolated FRB domain, and facilitated the analysis of rapamycin and FK506 binding using differential scanning calorimetry (DSC) and solution nuclear magnetic resonance (NMR). DSC enabled the rapid observation of protein-drug interactions at the domain level, while NMR gave insights into the protein-drug interactions at the residue level. The use of the FKBP12-FRB fusion protein combined with DSC and NMR provides a useful tool for the efficient screening of FKBP12-dependent as well as -independent inhibitors of the mTOR FRB domain.