Sporothrix Schenckiiの酵母形態型からの膜結合II型α-グルコシダーゼの精製と部分的な生化学的特性評価

糖タンパク質生合成の初期段階は、小胞体網状体α-グルコシダーゼIおよびIIによるN-グリカンコアの処理を含み、それぞれ最も外側のα1,2結合と、それぞれ2つの内部α1,3-結合グルコース単位を順次トリミングします。ヒトおよび動物の胞子症の病因であるSporothrix Schenckiiの糖タンパク質合成に必要な酵素機械の一部の成分の存在を実証しました。ただし、このプロセスに関する情報はまだ非常に限られています。ここでは、α-グルコシダーゼの分布分析により、総酵素活性の38％と50％がそれぞれ可溶性および混合膜画分に存在することが明らかになりました。後者から、酵素は可溶化され、見かけの均一性に精製され、生化学的に特徴付けられました。非変性電気泳動およびサイズ除外クロマトグラフィーによる酵素の分析により、それぞれ75.4および152.7 kDaの分子量が明らかになり、ホモ二量体構造が示唆されました。精製されたα-グルコシダーゼは、K（M）およびV（MAX）値から判断されるように、それぞれ高親和性が高い蛍光基質4-メチルバンバリフェリルα-D： - Mu/min/mgタンパク質の250 nmol値から判断されたように高いグルコピラノシドを切断しました。基質としての多数のグルコースα二糖化糖を使用した連鎖特異性の分析により、コジビオース（α1,2）、トレハロース（α1,1,1）などの他の基質よりも、α1,3結合二糖であるニゲロースの酵素の明確な好みが示されました。およびイソマルトース（α1,6）。1-デオキシノジリマイシン、カスタノスペミン、オーストラリンなどの処理α-グルコシダーゼの選択的阻害剤の使用により、α-グルコシダーゼの可能性のあるタイプのさらなる証拠が提供されました。したがって、Iよりもα-グルコシダーゼIIのより特異的な阻害剤である1-デオキシノジリマイシンは、4-メチルンバンバリフェリルα-D： - グルコピラノシドおよびナイゲロースの加水分解のより強力な阻害剤であり、カスタノスペミンよりもα-グルコシドゼI.阻害剤の優先阻害剤です。1-デオキシノジリマイシンおよびカスタノエスペルミンによるコジビオースとマルトースの加水分解は、ニゲロースのそれよりも有意に低かった。まとめると、これらの特性は、おそらくN-グリカン処理に関与するII型α-グルコシダーゼと一致しています。私たちの知る限り、これは本当に二形性菌におけるそのような活動の最初の報告です。

The early steps of glycoprotein biosynthesis involve processing of the N-glycan core by endoplasmic reticulum α-glucosidases I and II which sequentially trim the outermost α1,2-linked and the two more internal α1,3-linked glucose units, respectively. We have demonstrated the presence of some components of the enzymic machinery required for glycoprotein synthesis in Sporothrix schenckii, the etiological agent of human and animal sporotrichosis. However, information on this process is still very limited. Here, a distribution analysis of α-glucosidase revealed that 38 and 50% of total enzyme activity were present in a soluble and in a mixed membrane fraction, respectively. From the latter, the enzyme was solubilized, purified to apparent homogeneity and biochemically characterized. Analysis of the enzyme by denaturing electrophoresis and size exclusion chromatography revealed molecular masses of 75.4 and 152.7 kDa, respectively, suggesting a homodimeric structure. Purified α-glucosidase cleaved the fluorogenic substrate 4-methylumbelliferyl-α-D: -glucopyranoside with high affinity as judged from K(m) and V(max) values of 0.3 μM and 250 nmol of MU/min/mg protein, respectively. Analysis of linkage specificity using a number of glucose α-disaccharides as substrates demonstrated a clear preference of the enzyme for nigerose, an α1,3-linked disaccharide, over other substrates such as kojibiose (α1,2), trehalose (α1,1) and isomaltose (α1,6). Use of selective inhibitors of processing α-glucosidases such as 1-deoxynojirimycin, castanospermine and australine provided further evidence of the possible type of α-glucosidase. Accordingly, 1-deoxynojirimycin, a more specific inhibitor of α-glucosidase II than I, was a stronger inhibitor of hydrolysis of 4-methylumbelliferyl-α-D: -glucopyranoside and nigerose than castanospermine, a preferential inhibitor of α-glucosidase I. Inhibition of hydrolysis of kojibiose and maltose by 1-deoxynojirimycin and castanoespermine was significantly lower than that of nigerose. Taken together, these properties are consistent with a type II-like α-glucosidase probably involved in N-glycan processing. To our knowledge, this is the first report of such an activity in a truly dimorphic fungus.