液体クロマトグラフィーの反応モニタリングを使用した高感度の方法の開発生物マトリックスの膜P糖タンパク質と輸送機能との関係を定量化する

生物学的マトリックスにおけるP-糖タンパク質[P-gp、Abcb1、多剤耐性1（MDR1）]タンパク質の定量化は、in vivoの状況へのin vitro官能データの有用な翻訳およびin vitroでの異なるモデル間のトランスポーターデータの比較のために欠けている重要な要因と考えられています。本研究では、異なる生物学的マトリックスのP-GP膜タンパク質レベルを定量化するために、液体クロマトグラフィー（LC） - 質量分析法が開発されました。P-gpトランスポータータンパク質の量は、CACO-2細胞単層および内側のヒト胚腎（HEK）-MDR1小胞で測定されました。両方のin vitroシステムから、異なる機能を持つ2つの準備が使用されました。トランスポーター機能は、CACO-2細胞単層およびN-メチルキニジン（NMQ）の膜小胞におけるジゴキシン流出として決定され、さらにCACO-2単層のmRNA発現が測定されました。結果は、内側のHEK-MDR1小胞とタンパク質含有量におけるNMQ取り込み機能との間に優れた関係を示しました。異なるCACO-2細胞培養におけるジゴキシン流出とP-gp含有量の間の同様の一致が観察されましたが、mRNAレベルは古いCACO-2培養でのP-gp含有量と活性の増加を示していますが、同じ定量的関係を生成しません。CACO-2とHEK-MDR1膜小胞の両方の結果は、タンパク質含有量がそれぞれのシステムの活動レベルに直接関係していることを確認しています。LC-Multiple反応モニタリングによりP-GPタンパク質を定量化するためにここに示されている方法は、発現システムと細胞/組織モデルの間の橋渡しとin vitroモデルから臓器全体に拡大する将来の方法論の開発を促進します。

The quantification of P-glycoprotein [P-gp, ABCB1, multidrug resistance 1 (MDR1)] protein in biological matrices is considered a key factor missing for useful translation of in vitro functional data to the in vivo situation and for comparison of transporter data among different in vitro models. In the present study a liquid chromatography (LC)-mass spectrometry method was developed to quantify P-gp membrane protein levels in different biological matrices. The amount of P-gp transporter protein was measured in Caco-2 cell monolayers and in inside-out human embryonic kidney (HEK)-MDR1 vesicles. From both in vitro systems, two preparations with different functionality were used. Transporter function was determined as digoxin efflux in Caco-2 cell monolayers and N-methylquinidine (NMQ) uptake in membrane vesicles, and, in addition, mRNA expression in the Caco-2 monolayers was measured. The results showed an excellent relationship between NMQ uptake functionality in inside-out HEK-MDR1 vesicles and protein contents. Similar concordance between the digoxin efflux and P-gp content in different Caco-2 cell cultures was observed, whereas mRNA levels are indicative of increased P-gp content and activity in older Caco-2 cultures, however, not yielding the same quantitative relationship. The results from both Caco-2 and HEK-MDR1 membrane vesicles confirm that the protein content is directly related to the level of activity in the respective system. The method presented here to quantify P-gp protein by LC-multiple reaction monitoring will facilitate the development of future methodologies to bridge between expression systems and cell/tissue models and to scale from in vitro models to whole organs.