基質の末端アミン同位体標識によるタンパク質分解イベントと天然Nターミノームの識別と定量化

タンパク質N末端の配列と性質の分析には、多くの用途があります。ヒトプロテオームプロジェクトでプロテオーム注釈のためのタンパク質の末端を定義することは、重要性が高まっています。基質発見のための分解のプロテアーゼ切断部位のターミノミクス分析は、重要な新しいアプリケーションです。Here we describe the step-by-step procedures for performing terminal amine isotopic labeling of substrates (TAILS), a 2- to 3-d (depending on method of labeling) high-throughput method to identify and distinguish protease-generated neo-N成熟したタンパク質n末端からの終末期は、すべての自然な修正を伴う自信を持っています。Tailsは、すべてのN末端ペプチドを濃縮するために負の選択を使用し、識別因子として一次アミン標識ベースの定量化を使用します。標識は多用途であり、in vitroでの生化学および細胞培養分析を含む多くのアプリケーションに適しています。動物およびヒトのソースからの組織サンプルを使用したin vivo分析も容易に実行できます。タンパク質レベルでは、N末端およびリジンアミンは、ジメチル化（ホルムアルデヒド/シアノボロヒドリドナトリウム）によってブロックされ、細胞培養ラベルにアミノ酸を含む重いジメチル化試薬または安定した同位体標識を組み込むことにより、同位体的に標識されます。あるいは、Amineブロッキングと等値性タグを使用して、ITRAQとしても知られる相対的および絶対定量化のために、簡単なマルチプレックスサンプル分析を実現できます。トリプシン消化後、N末端のトリプシン酸性ペプチドと現在N末端アルファアミンを持っているC末端ペプチドを結合する高分子量樹状ポリグリセロールアルデヒドポリマーを使用して、N末端ペプチド分離が達成されます。自然にブロックされていない（アセチル化、環化、メチル化など）または標識成熟したN末端およびNeo-N末端ペプチドは、限外ろ過により回収され、タンデム質量分析（MS/MS）によって分析されます。階層的基質は、ペプチド同位体の定量化とバイオインフォマティクスの検索基準により、バックグラウンドタンパク質分解生成物および非切断タンパク質から基質を識別します。

Analysis of the sequence and nature of protein N termini has many applications. Defining the termini of proteins for proteome annotation in the Human Proteome Project is of increasing importance. Terminomics analysis of protease cleavage sites in degradomics for substrate discovery is a key new application. Here we describe the step-by-step procedures for performing terminal amine isotopic labeling of substrates (TAILS), a 2- to 3-d (depending on method of labeling) high-throughput method to identify and distinguish protease-generated neo-N termini from mature protein N termini with all natural modifications with high confidence. TAILS uses negative selection to enrich for all N-terminal peptides and uses primary amine labeling-based quantification as the discriminating factor. Labeling is versatile and suited to many applications, including biochemical and cell culture analyses in vitro; in vivo analyses using tissue samples from animal and human sources can also be readily performed. At the protein level, N-terminal and lysine amines are blocked by dimethylation (formaldehyde/sodium cyanoborohydride) and isotopically labeled by incorporating heavy and light dimethylation reagents or stable isotope labeling with amino acids in cell culture labels. Alternatively, easy multiplex sample analysis can be achieved using amine blocking and labeling with isobaric tags for relative and absolute quantification, also known as iTRAQ. After tryptic digestion, N-terminal peptide separation is achieved using a high-molecular-weight dendritic polyglycerol aldehyde polymer that binds internal tryptic and C-terminal peptides that now have N-terminal alpha amines. The unbound naturally blocked (acetylation, cyclization, methylation and so on) or labeled mature N-terminal and neo-N-terminal peptides are recovered by ultrafiltration and analyzed by tandem mass spectrometry (MS/MS). Hierarchical substrate winnowing discriminates substrates from the background proteolysis products and non-cleaved proteins by peptide isotope quantification and bioinformatics search criteria.