ゲル電気泳動を使用したモビリティシフトDNA結合アッセイ

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を使用したDNA結合アッセイは、配列特異的DNA結合タンパク質を検出するための単純で迅速かつ非常に敏感な方法を提供します。エンドラベルDNAフラグメントに特異的に結合するタンパク質は、電気泳動中の断片の可動性を遅らせ、個々のタンパク質DNA複合体に対応する離散バンドをもたらします。このユニットで説明されているアッセイは、精製されたタンパク質または粗抽出物に見られる特性因子の結合をテストするために使用できます。また、このアッセイは、DNA結合タンパク質の親和性、存在量、関連率定数、解離速度定数、および結合特異性の定量的決定を可能にします。3つの追加プロトコルは、非標識競合他社DNA、抗体スーパーシフトアッセイ、および多成分ゲルシフトアッセイを使用した競合アッセイを説明しています。

DNA-binding assay using nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) provides a simple, rapid, and extremely sensitive method for detecting sequence-specific DNA-binding proteins. Proteins that bind specifically to an end-labeled DNA fragment retard the mobility of the fragment during electrophoresis, resulting in discrete bands corresponding to the individual protein-DNA complexes. The assay described in this unit can be used to test binding of purified proteins or of uncharacterized factors found in crude extracts. This assay also permits quantitative determination of the affinity, abundance, association rate constants, dissociation rate constants, and binding specificity of DNA-binding proteins. Three additional protocols describe a competition assay using unlabeled competitor DNA, an antibody supershift assay, and multicomponent gel shift assays.