可逆的主要組織適合性複合複合体Ni（2+） - ニトリロトリア酢酸ペプチドとヒスチジンタグを含むI-ペプチドマルチマーは、CD8（+）T細胞の分析と並べ替えを改善します

フィコエリトリン（PE）ストレプトアビジン（SA）に結合したビオチン化MHC-ペプチド複合体を含むMHC-ペプチドマルチマーは、抗原特異的T細胞の分析とソートに広く使用されています。ここでは、従来の試薬よりも優れた代替T細胞染色試薬について説明します。それらは、オリゴヒスチジンを含むNi（2+） - ニトリロトリア酢酸（NTA）の可逆的なキレート複合体の上に構築されています。従来の固相ペプチド化学を使用して、ビオチン化線形モノ、ディ、およびテトラ-NTA化合物を合成し、HIS（6）、His（12）、またはSA-Coated Sensor ChipsおよびEquilirium Diaysisisの表面プラズモン共鳴による2倍のHIS（6）タグを含むHLA-A*0201-ペプチド複合体との相互作用を研究しました。結合アビディティは、NTA地域の構成に応じて、それぞれ2倍の（6）タグ（2+）-NTA（2+）の組み合わせでピコモラK（d）に増加し、nta地域の構成に応じて、それぞれ（6）<2×his（6）およびnta（1）<nta（2）<nta（2）<nta（4）の順序で増加しました。HLA-A2-2×HIS（6） - ペプチドマルチマーは、Ni（2+）-NTA（4） - ビオチンおよびPE-SA-またはPE-NTA（4）染色されたインフルエンザおよびメランA特異的CD8+ T細胞を従来のマルチマーよりも等しく、またはそれ以上のいずれかを含む。これらの複合体は非常に安定していましたが、イミダゾールの存在下で非常に迅速に解離し、T細胞死を誘導することなく、真正な抗原特異的CD8+ T細胞の並べ替えとCD8+ T細胞のHLA-A2-ペプチドモノマー解離動態の評価を可能にしました。

MHC-peptide multimers containing biotinylated MHC-peptide complexes bound to phycoerythrin (PE) streptavidin (SA) are widely used for analyzing and sorting antigen-specific T cells. Here we describe alternative T cell-staining reagents that are superior to conventional reagents. They are built on reversible chelate complexes of Ni(2+)-nitrilotriacetic acid (NTA) with oligohistidines. We synthesized biotinylated linear mono-, di-, and tetra-NTA compounds using conventional solid phase peptide chemistry and studied their interaction with HLA-A*0201-peptide complexes containing a His(6), His(12), or 2×His(6) tag by surface plasmon resonance on SA-coated sensor chips and equilibrium dialysis. The binding avidity increased in the order His(6) < His(12) < 2×His(6) and NTA(1) < NTA(2) < NTA(4), respectively, depending on the configuration of the NTA moieties and increased to picomolar K(D) for the combination of a 2×His(6) tag and a 2×Ni(2+)-NTA(2). We demonstrate that HLA-A2-2×His(6)-peptide multimers containing either Ni(2+)-NTA(4)-biotin and PE-SA- or PE-NTA(4)-stained influenza and Melan A-specific CD8+ T cells equal or better than conventional multimers. Although these complexes were highly stable, they very rapidly dissociated in the presence of imidazole, which allowed sorting of bona fide antigen-specific CD8+ T cells without inducing T cell death as well as assessment of HLA-A2-peptide monomer dissociation kinetics on CD8+ T cells.