マウス骨芽細胞、骨芽細胞、マクロファージにおける定量的RT-PCR発現分析のための内部コントロール遺伝子

背景：リアルタイムの定量RT-PCR（QPCR）は、大きなダイナミックレンジでmRNA発現レベルを正確に定量化できる強力な手法です。これにより、QPCRは定量的遺伝子発現を研究するための最も広く使用されています。QPCRの重要な側面は、発現研究中のサンプル間のcDNA量を開始する違いを説明するために、適切なコントロールまたは正規化因子を選択することです。ここでは、骨芽細胞、骨芽細胞、マクロファージの分化における定量的遺伝子発現データの正確な正常化のための、ハウスキーパー遺伝子の簡潔なセットの選択について報告します。発現安定性を評価することにより、家政婦として機能する遺伝子の適合性を決定するアルゴリズムであるGenormの使用を実装しました。18S、ACTB、B2M、GAPDH、HMBS、およびHPRT1遺伝子の発現安定性を評価しました。 調査結果：私たちの分析により、18SとGAPDHは骨芽細胞の分化中に調節され、参照遺伝子としての使用には適していないことが明らかになりました。骨芽細胞で最も安定して発現した遺伝子はActB、HMBS、およびHPRT1であり、その幾何平均は、遺伝子発現データを正規化できる適切な正規化因子を構成します。マクロファージでは、18SおよびGAPDHが最も可変性のある遺伝子であり、HMBとB2Mは最も安定に発現した遺伝子でした。HMBSおよびB2M発現レベルの幾何平均は、マクロファージでの遺伝子発現分析中のcDNA量の開始の潜在的な違いを説明するための適切な正規化因子を形成します。破骨細胞における6つの候補参照遺伝子の発現安定性は、平均して、マクロファージで観察されたものよりも平均的なものでしたが、骨芽細胞で見られるものよりもわずかに変動しませんでした。破骨細胞で最も安定して発現した2つの遺伝子はHMBとB2Mであり、最大レベルの変動性を示す遺伝子は18SとGAPDHでした。特に、18SとGAPDHは、3つの細胞タイプすべてで最も異なる2つのコントロール遺伝子でした。HMBS、B2M、およびACTBの幾何平均は、破骨細胞における遺伝子発現研究に適切な正規化因子を作成します。 結論：骨芽細胞、骨芽細胞、マクロファージにおける定量的リアルタイムRT-PCR遺伝子発現研究の正常化因子として使用するのに適した遺伝子の簡潔なセットを特定しました。

BACKGROUND: Real-time quantitative RT-PCR (qPCR) is a powerful technique capable of accurately quantitating mRNA expression levels over a large dynamic range. This makes qPCR the most widely used method for studying quantitative gene expression. An important aspect of qPCR is selecting appropriate controls or normalization factors to account for any differences in starting cDNA quantities between samples during expression studies. Here, we report on the selection of a concise set of housekeeper genes for the accurate normalization of quantitative gene expression data in differentiating osteoblasts, osteoclasts and macrophages. We implemented the use of geNorm, an algorithm that determines the suitability of genes to function as housekeepers by assessing expression stabilities. We evaluated the expression stabilities of 18S, ACTB, B2M, GAPDH, HMBS and HPRT1 genes. FINDINGS: Our analyses revealed that 18S and GAPDH were regulated during osteoblast differentiation and are not suitable for use as reference genes. The most stably expressed genes in osteoblasts were ACTB, HMBS and HPRT1 and their geometric average constitutes a suitable normalization factor upon which gene expression data can be normalized. In macrophages, 18S and GAPDH were the most variable genes while HMBS and B2M were the most stably expressed genes. The geometric average of HMBS and B2M expression levels forms a suitable normalization factor to account for potential differences in starting cDNA quantities during gene expression analysis in macrophages. The expression stabilities of the six candidate reference genes in osteoclasts were, on average, more variable than that observed in macrophages but slightly less variable than those seen in osteoblasts. The two most stably expressed genes in osteoclasts were HMBS and B2M and the genes displaying the greatest levels of variability were 18S and GAPDH. Notably, 18S and GAPDH were the two most variably expressed control genes in all three cell types. The geometric average of HMBS, B2M and ACTB creates an appropriate normalization factor for gene expression studies in osteoclasts. CONCLUSION: We have identified concise sets of genes suitable to use as normalization factors for quantitative real-time RT-PCR gene expression studies in osteoblasts, osteoclasts and macrophages.