ミトコンドリアリボソームタンパク質L12は、ヒトミトコンドリアRNAポリメラーゼと選択的に関連して転写を活性化する

in vitroでのヒトミトコンドリアDNA（mtDNA）の基礎転写には、単一サブユニット、バクテリオファージ関連RNAポリメラーゼ、PolRMT、および転写因子H-MTTFB2が必要です。この2成分システムは、ヒトミトコンドリア転写因子A（H-MTTFA）によってmtDNAプロモーターで差別的に活性化されます。ミトコンドリアリボソームタンパク質L7/L12（MRPL12）はPolrMTに直接結合しますが、リボソームの文脈でそれを行うか、マトリックスの「遊離」タンパク質としてそうするかは不明です。さらに、MRPL12がミトコンドリア転写を活性化するという既存の証拠は、培養細胞の過剰発現研究と粗ミトコンドリア溶解物を使用した転写実験に由来し、転写に対するMRPL12の直接的な効果を割り当てます。ここでは、shRNAによるHELA細胞からのMRPL12の枯渇により、RNA安定性の変化によって説明されないミトコンドリア転写産物の定常状態レベルが低下することを報告します。また、MRPL12の重要な「遊離」プールがリボソームに関連していないヒトミトコンドリアに存在することも示しています。「フリー」MRPL12は、H-MTTFB2を含むものとは異なる複合体でin vivoで選択的に結合します。最後に、完全に組換えミトコンドリア転写システムを使用して、MRPL12がin vitroで直接プロモーター依存性およびプロモーターに依存しない転写を刺激することを実証します。これらの結果に基づいて、リボソームに関連していない場合、MRPL12は転写に2番目の機能を持ち、おそらく開始から伸長への移行を促進するように作用することを提案します。これは、ミトコンドリアリボソーム生合成とヒトミトコンドリアの転写を調整する1つのメカニズムであり、MtDNAからのRRNAの転写は、おそらく核エンコードされたMRPの輸入率とアセンブリの速度に従って調整する必要があると推測します。

Basal transcription of human mitochondrial DNA (mtDNA) in vitro requires the single-subunit, bacteriophage-related RNA polymerase, POLRMT, and transcription factor h-mtTFB2. This two-component system is activated differentially at mtDNA promoters by human mitochondrial transcription factor A (h-mtTFA). Mitochondrial ribosomal protein L7/L12 (MRPL12) binds directly to POLRMT, but whether it does so in the context of the ribosome or as a "free" protein in the matrix is unknown. Furthermore, existing evidence that MRPL12 activates mitochondrial transcription derives from overexpression studies in cultured cells and transcription experiments using crude mitochondrial lysates, precluding direct effects of MRPL12 on transcription to be assigned. Here, we report that depletion of MRPL12 from HeLa cells by shRNA results in decreased steady-state levels of mitochondrial transcripts, which are not accounted for by changes in RNA stability. We also show that a significant "free" pool of MRPL12 exists in human mitochondria not associated with ribosomes. "Free" MRPL12 binds selectively to POLRMT in vivo in a complex distinct from those containing h-mtTFB2. Finally, using a fully recombinant mitochondrial transcription system, we demonstrate that MRPL12 stimulates promoter-dependent and promoter-independent transcription directly in vitro. Based on these results, we propose that, when not associated with ribosomes, MRPL12 has a second function in transcription, perhaps acting to facilitate the transition from initiation to elongation. We speculate that this is one mechanism to coordinate mitochondrial ribosome biogenesis and transcription in human mitochondria, where transcription of rRNAs from the mtDNA presumably needs to be adjusted in accordance with the rate of import and assembly of the nucleus-encoded MRPs into ribosomes.