化学酵素合成とFcγ受容体抗体Fcドメインの均質なグリコフォームの二等分糖部分の存在は、FCに対するFcγIIIA受容体への親和性を高めます

構造的に明確に定義されたIgG-FCグリコフォームは、抗体エフェクター機能に対するグリコシル化の影響を理解するために非常に要求されています。この論文では、一連の均一なIgG-Fcグリコフォームの化学療法合成とFcγ受容体結合を報告します。化学酵素的アプローチは、ドナー基質として定義されたN-グリカンオキサゾリンの化学合成、α-マンノシダーゼ阻害剤キフネンシンの存在下でのCHO細胞株におけるFCドメインの発現、および脱glycosidase-カタリ化FCの糖化グリコシル化の存在下で構成されています。合成グリカンオキサゾリンを使用したドメイン（GLCNAC-FCホモディマー）。Arthrobacter Protophormiae（ENDO-A）の酵素は、FCグリコシル化リモデリング用の二等分の糖を含む誘導体を含むさまざまな修飾N-グリカンコアオキサゾリンを摂取するのに非常に効率的であることがわかりました。それにもかかわらず、Endo-AもMucor Hiemalisエンドグリコシダーゼ変異体（Endom-N175AおよびENDOM-N175Q）もFCドメインに完全に長さの複合型N-グリカンを伝達することができず、FCグリコシル化リモード化におけるこれら2つの酵素の制限を含めることができませんでした。。合成IgG-FCグリコフォームを用いた表面プラズモン共鳴（SPR）結合研究は、Fcコアフコシル化とは無関係に、二等分のGLCNAC部分の存在がFCのFcγRIIIAへの結合を大幅に促進できることを明確に証明しました。興味深いことに、マンノースやラクナック部分などの異常な二等分の糖部分を運ぶFCグリコフォームは、FcγRIIIAに対する親和性の強化も示しています。指で、二等分のGLCNACまたはコアフコシル化の存在は、阻害性Fcγ受容体FcγRIIBに対するFCの親和性にほとんど影響を与えませんでした。また、我々の実験データは、五糖類Man3Glcnac2コアのα結合マンノース残基が、FcγRIIIAとFcγRIIBの両方に対してFCの高い親和性を維持するために不可欠であることを示しました。したがって、合成均一なFCグリコフォームは、FCドメインの機能に微細なFC N-グリカン構造がどのように影響するかを解明するための便利なツールを提供します。

Structurally well-defined IgG-Fc glycoforms are highly demanded for understanding the effects of glycosylation on an antibody's effector functions. We report in this paper chemoenzymatic synthesis and Fcγ receptor binding of an array of homogeneous IgG-Fc glycoforms. The chemoenzymatic approach consists of the chemical synthesis of defined N-glycan oxazolines as donor substrates, the expression of the Fc domain in a CHO cell line in the presence of an α-mannosidase inhibitor kifunensine, and an endoglycosidase-catalyzed glycosylation of the deglycosylated Fc domain (GlcNAc-Fc homodimer) with the synthetic glycan oxazolines. The enzyme from Arthrobacter protophormiae (Endo-A) was found to be remarkably efficient to take various modified N-glycan core oxazolines, including the bisecting sugar-containing derivatives, for Fc glycosylation remodeling, resulting in the formation of the corresponding homogeneous Fc glycoforms. Nevertheless, neither Endo-A nor the Mucor hiemalis endoglycosidase mutants (EndoM-N175A and EndoM-N175Q) were able to transfer full-length complex-type N-glycan to the Fc domain, implicating the limitations of these two enzymes in Fc glycosylation remodeling. Surface plasmon resonance (SPR) binding studies with the synthetic IgG-Fc glycoforms unambiguously proved that the presence of a bisecting GlcNAc moiety could significantly enhance the binding of Fc to FcγRIIIa, the activating Fcγ receptor, independent of Fc core-fucosylation. Interestingly, the Fc glycoforms carrying an unusual bisecting sugar moiety such as a mannose or a LacNAc moiety also demonstrated enhanced affinity to FcγRIIIa. On the orther hand, the presence of a bisecting GlcNAc or core-fucosylation had little effect on the affinity of Fc to the inhibitory Fcγ receptor, FcγRIIb. Our experimental data also showed that the α-linked mannose residues in the pentasaccharide Man3GlcNAc2 core was essential to maintain a high affinity of Fc to both FcγRIIIa and FcγRIIb. The synthetic homogeneous Fc glycoforms thus provide a useful tool for elucidating how a fine Fc N-glycan structure precisely affects the function of the Fc domain.