RAAVを介した相同組換えによるブタ遺伝子ノックアウト：ユカタンとゲッティンゲン線維芽細胞のBRCA1遺伝子ノックアウト効率の比較は、わずかに異なる標的配列を持つ線維芽細胞

この研究では、ユカタンとゲッティンゲンミニピグ線維芽細胞の2つのRAAV-BRCA1 KOターゲティングコンストラクトの遺伝子標的効率を比較しました。コンストラクトの相同性群は、ユカタンゲノムDNAのPCRによって増幅されたエクソン配列のみで構成されていました。この配列は、Duroc Sowの参照ブタゲノム（Ensembl Susscrofa 9）およびLandrace品種のBrca1遺伝子（NCBIACC。No。AB271921）の配列と同一でした。驚くべきことに、ユカタン線維芽細胞で観察された非常に効率的な遺伝子ターゲティング（35％の標的効率）は、ゲッティンゲン線維芽細胞の2つの構成要素のいずれかを使用して完全に存在しないことがわかりました。GöttingenMinipigにおける関連するBRCA1エクソン11領域（〜2 kb）のシーケンスにより、コンストラクトの左相同アーム（塩基の0.3％）が標的とするシーケンスの3つの単一ヌクレオチドの違いが明らかになり、2つの右同族体の3つまたは7つ領域（それぞれ塩基の0.3または0.7％）。GöttingenGenomic DNA配列に基づいた新しいRaav-BRCA1ターゲティングベクターの構築により、効率はユカタン線維芽細胞で観察されたものよりもやや低かったが、遺伝子ターゲティングを再確立した。これらのBRCA1 KOGöttingen線維芽細胞クローンは、ユカタン品種で以前に行われたように、GöttingenBRCA1KOPIGモデルを生成するために、体細胞核移植の核ドナー細胞として使用されています。本研究は、効率的なRAAVターゲティングコンストラクトの相同性に存在するいくつかのミスマッチでさえ、エクソン配列のみで構成されるターゲティングコンストラクトを作成するためにも同質性DNAを使用することの重要性を強調する相同組換えによる遺伝子標的化を完全に除外できることを示しています。

In this study, we compared the gene targeting efficiencies of two rAAV-BRCA1 KO targeting constructs in Yucatan and Göttingen minipig fibroblasts. The homology arms of the constructs consisted exclusively of exonic sequences amplified by PCR from Yucatan genomic DNA. The sequences were identical to those of the reference porcine genome of a Duroc sow (Ensembl Susscrofa 9) and the BRCA1 gene of the Landrace breed (NCBI acc. no. AB271921). Surprisingly, we found that the very efficient gene targeting observed for Yucatan fibroblasts (35% targeting efficiency) was completely absent using either of the two constructs in Göttingen fibroblasts. Sequencing of the relevant BRCA1 exon 11 region (~2 kb) in the Göttingen minipig revealed three single nucleotide differences in the sequence targeted by the left homology arm of the construct (0.3% of the bases) and three or seven in the two right homology regions (0.3 or 0.7% of the bases, respectively). Construction of a novel rAAV-BRCA1 targeting vector based on the Göttingen genomic DNA sequence re-established gene targeting although the efficiency was somewhat lower than that observed for Yucatan fibroblasts. These BRCA1 KO Göttingen fibroblast clones have been used as nuclear donor cells for somatic cell nuclear transfer to generate a Göttingen BRCA1 KO pig model as previously done with the Yucatan breed. The present study illustrates that even a few mismatches present in the homology arms of an efficient rAAV-targeting construct can completely abolish gene targeting by homologous recombination emphasizing the importance of using isogenic DNA even for creating targeting constructs consisting of exon sequences only.