グルタミンシンテターゼ遺伝子ノックアウト細胞を使用してCHO細胞株の生成の効率を改善する

中国のハムスター卵巣（CHO）細胞は、独自の特性を備えていますが、治療的組換えタンパク質の製造のための主要な主力となっていますが、CHO細胞株の生成（CLG）の主要な課題の1つは、それらの希少で高性化する方法を効率的に特定する方法です。低および非生産的なクローンの大きな集団の間でクローンを生成します。許容可能な生産性と成長プロファイルを備えた市販のクローン細胞株の識別のために数百個の個別のクローンをスクリーニングする必要があることは珍しいことではありません。この非効率性により、時間がかかり、面倒なプロセスが生じます。現在、2つの主要なCHO発現システムがあります。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）ベースのメトトレキサート（MTX）選択とグルタミンシンテターゼ（GS）ベースのメチオニンスルホキシミン（MSX）選択があります。GS-CHO系における組換え細胞株の選択は、発現プラスミドによって導入されたGS遺伝子の発現と、内因性GS遺伝子からのGSの発現GS阻害剤L-MSXの添加によって導入されたGS遺伝子の発現のバランスに基づいています。親のCHOK1SV細胞は、選択プロセスを妨害する可能性があります。内因性GS発現の選択効率への潜在的な影響を研究するために、GS-Knockout CHOK1SV細胞株は、内因性CHO GS遺伝子を特異的に標的とするように設計された亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）テクノロジーを使用して生成されました。CHO GS遺伝子の二極修飾の高効率（〜2％）は、特にCHO細胞におけるZFNテクノロジーのユニークな利点をサポートしています。GS酵素機能の破壊は、すべてのGSノックアウト細胞株のグルタミン依存性成長の観察によって確認されました。標準的な産業細胞培養プロセスにおけるGSノックアウト細胞株の完全な評価が実行されました。バルク培養生産性は、親細胞としてGSノックアウト細胞を使用することにより、2〜3倍改善されました。25 µM L-MSX選択後の非産生および低生産細胞の大幅な減少によって示されるように、選択のストリンジェンシーは大幅に増加し、その結果、同様の数の高生産細胞株を識別することで6倍の効率改善が得られました。与えられた組換えモノクローナル抗体。組換えタンパク質の品質に対するGSノックアウト細胞の潜在的な影響についても議論されています。

Although Chinese hamster ovary (CHO) cells, with their unique characteristics, have become a major workhorse for the manufacture of therapeutic recombinant proteins, one of the major challenges in CHO cell line generation (CLG) is how to efficiently identify those rare, high-producing clones among a large population of low- and non-productive clones. It is not unusual that several hundred individual clones need to be screened for the identification of a commercial clonal cell line with acceptable productivity and growth profile making the cell line appropriate for commercial application. This inefficiency makes the process of CLG both time consuming and laborious. Currently, there are two main CHO expression systems, dihydrofolate reductase (DHFR)-based methotrexate (MTX) selection and glutamine synthetase (GS)-based methionine sulfoximine (MSX) selection, that have been in wide industrial use. Since selection of recombinant cell lines in the GS-CHO system is based on the balance between the expression of the GS gene introduced by the expression plasmid and the addition of the GS inhibitor, L-MSX, the expression of GS from the endogenous GS gene in parental CHOK1SV cells will likely interfere with the selection process. To study endogenous GS expression's potential impact on selection efficiency, GS-knockout CHOK1SV cell lines were generated using the zinc finger nuclease (ZFN) technology designed to specifically target the endogenous CHO GS gene. The high efficiency (∼2%) of bi-allelic modification on the CHO GS gene supports the unique advantages of the ZFN technology, especially in CHO cells. GS enzyme function disruption was confirmed by the observation of glutamine-dependent growth of all GS-knockout cell lines. Full evaluation of the GS-knockout cell lines in a standard industrial cell culture process was performed. Bulk culture productivity improved two- to three-fold through the use of GS-knockout cells as parent cells. The selection stringency was significantly increased, as indicated by the large reduction of non-producing and low-producing cells after 25 µM L-MSX selection, and resulted in a six-fold efficiency improvement in identifying similar numbers of high-productive cell lines for a given recombinant monoclonal antibody. The potential impact of GS-knockout cells on recombinant protein quality is also discussed.