スプリットマーカーアプローチを使用した菌類の標的遺伝子置換

標的遺伝子置換は、真菌遺伝子の機能的特性評価の主要な戦略の1つであり、長年にわたってこの目的のためにいくつかの方法が開発されてきました。現在のゲノム配列情報の利用可能性の向上により、遺伝子配列とその周辺領域の知識に基づいて、プロトコルの幅広い採用が可能になりました。このような標的化された遺伝子置換アプローチの中で、Spilt-Marker法は糸状菌で人気を博しています。この方法には2ラウンドのPCRのみが含まれており、サブクローニングは必要ありません。これは、マーカー遺伝子（例えば、ヒグロマイシン遺伝子）と目的の遺伝子の配列の可用性と、両側の遺伝子に隣接する約1 kbの長さの領域に基づいています。この手法には、目的の遺伝子の隣接領域とマーカー遺伝子の隣接領域のPCR増幅が含まれ、それに続いて融合PCRが続き、それぞれが1つの隣接領域に融合したマーカー遺伝子の一部を含む2つの分子カセットの作成につながります。これらの分子カセットは、プロトプラストの変換に同時に使用されます。3つの相同組換えイベント、1つは各隣接領域内とマーカー遺伝子内の1つは、関心のある遺伝子が機能マーカー遺伝子を置き換えることにつながります。次に、形質転換体は選択的な培地で成長し、新興コロニーはマーカーの存在とさまざまな方法を使用して置換される遺伝子の欠如のためにスクリーニングできます。

Targeted gene replacement is one of the primary strategies for functional characterization of fungal genes and several methods have been developed for this purpose over the years. The increased availability of genome sequence information in the present times has enabled wider adoption of protocols based on the knowledge of the gene sequence and its surrounding region. Among such targeted gene replacement approaches, the spilt-marker method has gained popularity in filamentous fungi. This method involves only two rounds of PCR and does not require any subcloning. It is based on the availability of a marker gene (e.g., the hygromycin gene) and sequences of the gene of interest, as well as around 1 kb long regions flanking the gene on either side. The technique includes PCR amplification of the flanking regions of the gene of interest and the marker gene followed by a fusion PCR which leads to the creation of two molecular cassettes, each containing a part of the marker gene fused to one flanking region. These molecular cassettes are then simultaneously used for transformation of protoplasts. Three homologous recombination events, one within each flanking region and one in the marker gene, lead to the replacement of the gene of interest with a functional marker gene. The transformants are then grown on selective media and emerging colonies can be screened for presence of the marker and absence of the gene being replaced using various methods.