ニコチン酸（ビタミンB3）の構造と触媒メカニズムBordetella bronchiseptica RB50の分解酵素アミドヒドロラーゼアミドヒドロラーゼ

いくつかの好気性細菌におけるニコチン酸塩（ビタミンB（3））のフマレートへの酸化分解における最後から2番目の反応は、マラマートアミドヒドロラーゼ（NICF）によって触媒されるマレア酸塩の加水分解脱アミノ化です。N-ヘテロサイクリック化合物の細菌分解のモデルシステムと見なされていますが、最近では、この異化経路の酵素をコードする遺伝子クラスターが、メカニズムの構造的基礎に関する詳細な調査を可能にするために特定されました。ここでは、NICFと推定されているBordetella bronchiseptica rb50のBB1774遺伝子がクローン化されており、大腸菌から過剰発現して精製した組換え酵素は、マレア酸塩およびアマニウムイオンへの消滅性の加水分解を効率的に触媒することが示されています。等温滴定熱量測定（ITC）による反応の定常状態の運動分析は、それぞれ11.7±0.2秒（-1）および128±6μmのK（CAT）およびK（M）値（pH 7.5および25°C）を確立しました（pH 7.5および25°C）。。ITCでも測定されたNICF・マレート（E・P）複合体の観測されたk（d）は、3.8±0.4 mmに近似されています。分子置換を使用して2.4Åで決定されたNICFの結晶構造は、酵素がシステインヒドロラーゼスーパーファミリーに属していることを示しています。この構造は、潜在的な触媒的に重要な残基の役割に関する洞察を提供します。最も顕著なのは、活性空洞内の保存された非プロリンシスペプチド結合の近接で観察される保存された触媒トライアド（ASP29、Lys117、およびCys150）が活性である可能性が高い小さな空洞内で観察されます。サイト。この構造情報に基づいて、Cys150のチオレート側鎖を含む求核性添加除去配列によって進行するために、マラマートの加水分解が提案されています。

The penultimate reaction in the oxidative degradation of nicotinate (vitamin B(3)) to fumarate in several species of aerobic bacteria is the hydrolytic deamination of maleamate to maleate, catalyzed by maleamate amidohydrolase (NicF). Although it has been considered a model system for bacterial degradation of N-heterocyclic compounds, only recently have gene clusters that encode the enzymes of this catabolic pathway been identified to allow detailed investigations concerning the structural basis of their mechanisms. Here, the Bb1774 gene from Bordetella bronchiseptica RB50, putatively annotated as nicF, has been cloned, and the recombinant enzyme, overexpressed and purified from Escherichia coli, is shown to catalyze efficiently the hydrolysis of maleamate to maleate and ammonium ion. Steady-state kinetic analysis of the reaction by isothermal titration calorimetry (ITC) established k(cat) and K(M) values (pH 7.5 and 25 °C) of 11.7 ± 0.2 s(-1) and 128 ± 6 μM, respectively. The observed K(D) of the NicF·maleate (E·P) complex, also measured by ITC, is approximated to be 3.8 ± 0.4 mM. The crystal structure of NicF, determined at 2.4 Å using molecular replacement, shows that the enzyme belongs to the cysteine hydrolase superfamily. The structure provides insight concerning the roles of potential catalytically important residues, most notably a conserved catalytic triad (Asp29, Lys117, and Cys150) observed in the proximity of a conserved non-proline cis-peptide bond within a small cavity that is likely the active site. On the basis of this structural information, the hydrolysis of maleamate is proposed to proceed by a nucleophilic addition-elimination sequence involving the thiolate side chain of Cys150.