分割ユビキチン膜酵母2ハイブリッド系を使用した膜タンパク質相互作用の調査

タンパク質は一般に分子複合体に組織化されており、複数の相互作用パートナーが協力して細胞プロセスを実行します。したがって、タンパク質間相互作用をマッピングする技術は、まだ非特性化されていないタンパク質の生物学的研究にとって極めて重要になっています。膜タンパク質の相互作用パートナーの調査は、細胞プロセスで大きな役割を果たし、しばしばヒト疾患に直接関連しているため、特に興味深いものです。しかし、疎水性の性質により、相互作用パートナーを研究することは困難であることが証明されています。この問題を回避するために、膜タンパク質相互作用のin vivo検出のための酵母ベースの遺伝子技術であるスプリットウビキチン膜酵母2ハイブリッド（神話）システムが開発されました。神話は、安定した相互作用と一時的な相互作用の両方を検出することを可能にし、大規模および小規模なスクリーンに適用できます。スプリットウビキチンアプローチを使用します。このアプローチでは、2つのユビキチンの半分の再構成が特定のタンパク質間相互作用によって媒介されます。簡単に言えば、ベイト膜タンパク質は、ユビキチンのC末端半分と人工転写因子に融合します。ユビキチンの変異したN末端部分は、獲物のタンパク質に融合されます。餌と獲物のタンパク質の相互作用により、ユビキチンは再構成され、ユビキチン特異的プロテアーゼによってさらに認識され、その後転写因子から切断され、レポーター遺伝子の活性化が生じます。これまで、神話はさまざまな生物の膜タンパク質の相互作用の研究に成功しており、哺乳類受容体チロシンキナーゼの相互作用パートナーの同定に最近適応されたばかりです。

Proteins are generally organized into molecular complexes, in which multiple interaction partners collaborate to carry out cellular processes. Thus, techniques to map protein-protein interactions have become pivotal for biological studies of as yet uncharacterized proteins. Investigation of interaction partners of membrane proteins is of special interest, as they play a major role in cellular processes and are often directly linked to human diseases. Owing to their hydrophobic nature, however, it has proven difficult to study their interaction partners. To circumvent this problem, a yeast-based genetic technology for the in vivo detection of membrane protein interactions, the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid (MYTH) system, has been developed. MYTH allows for detection of both stable and transient interactions and can be applied to large- and small-scale screens. It uses the split-ubiquitin approach, in which the reconstitution of two ubiquitin halves is mediated by a specific protein-protein interaction. Briefly, the bait membrane protein is fused to the C-terminal half of ubiquitin and an artificial transcription factor. The mutated N-terminal moiety of ubiquitin is fused to the prey protein. Upon interaction of bait and prey proteins, ubiquitin is reconstituted and further recognized by ubiquitin-specific proteases, which subsequently cleave off the transcription factor, thus resulting in reporter gene activation. To date, MYTH has been successfully applied to study interactions of membrane proteins from various organisms and has only recently been adapted for the identification of interaction partners of mammalian receptor tyrosine kinases.