dsr-eグルカンスクラーゼに由来するα-（1-> 2）分岐スクラーゼの機能的および構造的特性評価

ΔN（123） - グルカン結合ドメイン触媒ドメイン2（ΔN（123）-GBD-CD2）は、Leuconostoc Mesenteroides NRRL B-299からの二機能性グルカンスクラーゼDSR-Eの切り捨てられた形態です。GBD-CD2の合理的な切り捨てによって構築されました。これは、DSR-Eの2番目の触媒ドメインを備えています。GBD-CD2と同様に、このバリアントは、スクロースとグルコシルドナーとしてインキュベートし、アクセプターとして（オリゴ）dextranをインキュベートすると、α-（1→2）分岐活性を表示し、ピンポンBI-BIメカニズムを介してグルコシル残基をアクセプターに移します。これにより、制御された量のα-（1→2）結合を含むプレバイオティクス分子の形成が可能になります。APOα-（1→2）分岐スクラーゼΔN（123）-GBD-CD2の結晶構造は、1.90Åの解像度で解決されました。タンパク質は、グリコシドヒドロラーゼファミリー70。Subruceおよび触媒のグルコシル残基の結合に関与するサブサイト-1を形成するGTF180-ΔNおよびGTF-SIグルカンスクラゼにも見られる5つの異なるドメインに組織された異常なU字型の折り目を採用しています。GTF180-ΔNとΔN（123）-GBD-CD2の両方で厳密に保存されています。サブサイト+1分析により、ΔN（123）-GBD-CD2に固有の3つの残基（ALA-2249、GLY-2250、およびPHE-2214）が明らかになりました。GTF180-ΔNで見つかった対応する残基に対するこれらの残基の変異は、ALA-2249およびGLY-2250が基質結合とレジオ特異性に直接関与していないことを示しました。対照的に、ミュータントF2214Nはデキストランを分岐する能力を失いましたが、スクロースのみで活動していました。さらに、触媒渓谷の上部にあるドメインAおよびBに属する3つのループもΔN（123）-GBD-CD2に固有です。これらの際立った特徴は、α-（1→2）枝の形成を可能にするデキストランアクセプター分子の正しい位置に関与することも提案されています。

ΔN(123)-glucan-binding domain-catalytic domain 2 (ΔN(123)-GBD-CD2) is a truncated form of the bifunctional glucansucrase DSR-E from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299. It was constructed by rational truncation of GBD-CD2, which harbors the second catalytic domain of DSR-E. Like GBD-CD2, this variant displays α-(1→2) branching activity when incubated with sucrose as glucosyl donor and (oligo-)dextran as acceptor, transferring glucosyl residues to the acceptor via a ping-pong bi-bi mechanism. This allows the formation of prebiotic molecules containing controlled amounts of α-(1→2) linkages. The crystal structure of the apo α-(1→2) branching sucrase ΔN(123)-GBD-CD2 was solved at 1.90 Å resolution. The protein adopts the unusual U-shape fold organized in five distinct domains, also found in GTF180-ΔN and GTF-SI glucansucrases of glycoside hydrolase family 70. Residues forming subsite -1, involved in binding the glucosyl residue of sucrose and catalysis, are strictly conserved in both GTF180-ΔN and ΔN(123)-GBD-CD2. Subsite +1 analysis revealed three residues (Ala-2249, Gly-2250, and Phe-2214) that are specific to ΔN(123)-GBD-CD2. Mutation of these residues to the corresponding residues found in GTF180-ΔN showed that Ala-2249 and Gly-2250 are not directly involved in substrate binding and regiospecificity. In contrast, mutant F2214N had lost its ability to branch dextran, although it was still active on sucrose alone. Furthermore, three loops belonging to domains A and B at the upper part of the catalytic gorge are also specific to ΔN(123)-GBD-CD2. These distinguishing features are also proposed to be involved in the correct positioning of dextran acceptor molecules allowing the formation of α-(1→2) branches.