フタレートで成長したPseudomonas ochraceaeからの4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタレートアルドラーゼの精製と特性

4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタル酸アルドラーゼ[4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグル酸ピルビン酸 - リロイゼ：EC 4.1.3.17]は、均一に精製されています（約770倍精製、11.4％の収穫量11.4％）Pseudomonas ochraceaeはフタル酸で栽培されています。酵素の分子量は160,000（バイオゲルA-1.5Mのゲルろ過）、サブユニット分子量の26,000（SDS-PAGE）、および5.0の等電点（等電力焦点）です。酵素には、活性にはMg2+、Mn2+、Co2+、Zn2+、CD2+などの二価金属イオンが必要です。酵素は、酵素の生理学的基質である4-カルボキシ-4-ヒドロキシ-2-オキソアジペートを積極的に切断して、ピルビン酸塩とオキサロ酢酸を投与しますが、4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグル酸塩に対する親和性がはるかに低くなります。4-ヒドロキシ-2-オキソグルタレートは、ピルビン酸およびグリオキシレートのために低い速度で切断されます。基質のL異性体は、偏光で決定されたD異性体よりも優先的に切断されています。酵素反応は可逆的です：HMGおよびHG切断反応の平衡定数（pH 8.0、25 C）はそれぞれ約0.07および0.03 Mであり、一方、酵素に関連するオキサロアセテートベータデカルボキシラーゼ活性のため、CHAでは平衡は観察されません。。酵素活性は、チオールやチオールの試薬によってほとんど影響を受けません。さまざまな金属イオンによって引き起こされる非酵素切断反応も、酵素反応と機械的類似性を調べるために研究されています。

4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase [4-hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarate pyruvate-lyase: EC 4.1.3.17] has been purified to homogeneity (about 770-fold purification, yield 11.4%) from Pseudomonas ochraceae grown on phthalate. The enzyme has a molecular weight of 160,000 (gel filtration on Bio-Gel A-1.5m), a subunit molecular weight of 26,000 (SDS-PAGE) and an isoelectric point of 5.0 (isoelectric focusing). The enzyme requires divalent metal ions such as Mg2+, Mn2+, Co2+, Zn2+, and Cd2+ for activity. The enzyme actively cleaves 4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate, a physiological substrate of the enzyme, to give pyruvate and oxaloacetate, but shows much lower affinity for 4-hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarate. 4-Hydroxy-2-oxoglutarate is cleaved at a low rate to pyruvate and glyoxylate. The l-isomers of the substrates are preferentially cleaved rather than the d-isomers as determined polarimetrically. The enzyme reactions are reversible: the equilibrium constants (pH 8.0, 25 C) for the HMG and HG cleavage reactions are about 0.07 and 0.03 M, respectively, whereas no equilibrium is observed with CHA due to oxaloacetate beta-decarboxylase activity associated with the enzyme. The enzyme activity is hardly affected by thiols and thiol reagents. The non-enzymatic cleavage reaction caused by various metal ions has also been studied to examine the mechanistic similarity to the enzymatic reaction.