安定した三元複合体形成と大腸菌におけるリーダーレスmRNAの翻訳には5'末端のリン酸が必要です

バクテリオファージλのCI mRNAは、大腸菌におけるリーダーとリーダーのないmRNAの発現に関する5'末端リン酸の重要性を調べるために利用されました。ハンマーヘッドリボザイムを使用して、5'-ヒドロキシルを含むin vivoおよびin vitroでリーダーでリーダーレスmRNAを生成しました。これらのmRNAは細菌細胞で自然に発生しない可能性がありますが、リーダーとリーダーのないmRNAのリボソーム結合と翻訳における5'リン酸化状態の重要性の研究を可能にします。5'-リン酸または5'-ヒドロキシルのいずれかを含むmRNAを使用した分析は、リーダーレスCI mRNAには、in vitroでの安定したリボソーム結合に5'-リン酸が必要であること、およびin vivoでの発現が必要であることを示しています。リボソーム結合アッセイは、30Sサブユニットと70年代のリボソームが、リーダーレスmRNAを含む5'-リン酸と同じように5'-ヒドロキシルに強く結合しないことを示しています。さらに、フィルター結合アッセイにより、5'-ヒドロキシルを含むリーダーレスmRNAで形成された70年代の三元複合体は、5'-リン酸と比較して4.5倍高い解離速度（K（OFF））を持っていることが明らかになりました。リーダーレスmRNA。LACZレポーター遺伝子への融合は、5'-ヒドロキシルを使用したリーダーレスCI mRNA発現が、5'-リン酸を含む同等のmRNAよりも100倍> 100倍低いことを明らかにしました。これらのデータは、5'-リン酸が安定したリボソーム結合と発現のためのリーダーレスmRNAの重要な特徴であることを示しています。

The bacteriophage λ's cI mRNA was utilized to examine the importance of the 5'-terminal phosphate on expression of leadered and leaderless mRNA in Escherichia coli. A hammerhead ribozyme was used to produce leadered and leaderless mRNAs, in vivo and in vitro, that contain a 5'-hydroxyl. Although these mRNAs may not occur naturally in the bacterial cell, they allow for the study of the importance of the 5'-phosphorylation state in ribosome binding and translation of leadered and leaderless mRNAs. Analyses with mRNAs containing either a 5'-phosphate or a 5'-hydroxyl indicate that leaderless cI mRNA requires a 5'-phosphate for stable ribosome binding in vitro as well as expression in vivo. Ribosome-binding assays show that 30S subunits and 70S ribosomes do not bind as strongly to 5'-hydroxyl as they do to 5'-phosphate containing leaderless mRNA and the tRNA-dependent ternary complex is less stable. Additionally, filter-binding assays revealed that the 70S ternary complex formed with a leaderless mRNA containing a 5'-hydroxyl has a dissociation rate (k(off)) that is 4.5-fold higher compared with the complex formed with a 5'-phosphate leaderless mRNA. Fusion to a lacZ reporter gene revealed that leaderless cI mRNA expression with a 5'-hydroxyl was >100-fold lower than the equivalent mRNA with a 5'-phosphate. These data indicate that a 5'-phosphate is an important feature of leaderless mRNA for stable ribosome binding and expression.