IgG1 mabの凝集と立体構造に対するpHと光の効果

精製プロセス中、モノクローナル抗体は、さまざまなバッファーおよびpH条件下で、UV-C（200〜290 nm）、UV-B（290〜320 nm）、および可視光（400〜760 nm）にさらされる可能性があります。一緒に、これらの条件は、構造の変化をもたらす可能性のある化学的および物理的な劣化の両方を促進できます。この可能性を調べるために、pH 3.5、5、および8のIgG1 mAbが複数のタンパク質濃度で紫外線にさらされました。302 nm光への曝露は、高分子量種のpH依存性形成をもたらし、pHの増加とともにオリゴマー化の程度が増加しました。還元条件と非還元条件およびサイズの排除マルの下でのSDS-PAGEによる特性評価により、主要な種は、分子間ジスルフィド結合形成以外のプロセスを通じて発生した還元不可能な二量体、三量体、高次のオリゴマー種であることが明らかになりました。微分走査熱量測定による生物物理性化により、熱容量の全体的な喪失が示され、光暴露による立体配座の完全性の喪失が示唆されました。トリプトファン蛍光の減少は、光曝露後の熱誘起展開中に測定された遷移温度の有意な低下と並行して、立体構造の完全性の有意な変化を示唆しています。蛍光分光法による観察は、フーリエ変換赤外線分光法と遠方UVの循環二色性を特徴とする二次構造の変化のpH依存性の変化と一致し、最も酸性のpHがβシート構造の最大の変化を示しました。UV光への曝露は、8.0> 5.0> 3.5のオーダーでpH依存性の収率が減少する凝集をもたらしましたが、コンフォメーションの変化については反対の傾向が観察され、pH依存性の伸長は次の順序で3.5> 5.0> 8.0で減少しました。これらのpH依存トレンドは、処理中のこれらの修飾に対してタンパク質を安定させるために、さまざまな戦略が必要であることを示唆しています。

During the purification process, monoclonal antibodies may be exposed to parts of UV-C (200 to 290 nm), UV-B (290 to 320 nm) and visible light (400 to 760 nm) under a variety of buffer and pH conditions. Together, these conditions can promote both chemical and physical degradation which may result in conformational changes. To examine this possibility, an IgG1 mAb at pH 3.5, 5, and 8 was exposed to UV light at multiple protein concentrations. Exposure to 302 nm light resulted in a pH-dependent formation of high molecular weight species where the degree of oligomerization increased with increasing pH. Characterization by SDS-PAGE under reducing and nonreducing conditions and size exclusion MALS revealed that the predominant species were nonreducible dimeric, trimeric and higher order oligomeric species which occurred through processes other than intermolecular disulfide bond formation. Biophysical characterization by differential scanning calorimetry demonstrated an overall loss of heat capacity suggesting a loss of conformational integrity with light exposure. A decrease in tryptophan fluorescence was paralleled by a significant decrease in the transition temperature measured during heat-induced unfolding following light exposure, also suggesting a significant change in conformational integrity. The observations by fluorescence spectroscopy coincided with pH-dependent changes in the alterations of secondary structure characterized by Fourier transform infrared spectroscopy and far-UV circular dichroism with the most acidic pH showing the greatest degree of change in the β-sheet structure. Exposure to UV light resulted in aggregation with pH-dependent yields decreasing in the order 8.0 > 5.0 > 3.5, while the opposite trend was observed for conformational changes, with pH-dependent extents decreasing in the following order 3.5 > 5.0 > 8.0. These pH-dependent trends suggest that different strategies will be required to stabilize the protein against these modifications during processing.