ノコダゾールとブレビスタチンを使用した同期による中期、無段、およびテルフェーズの細胞集団の濃縮：有糸分裂進行中のタンパク質の動的変化を調べるのに適した新しい方法

有糸分裂は、預言、中期、無段、およびテルフェーズを介して、複製された染色体を2つの娘細胞に分離する継続的なプロセスです。細胞周期のさまざまな段階で細胞を同期するために多くの方法が確立されていますが、無次第期間のために、有糸分裂の間、特定の相、骨中、およびテルフェースで細胞を同期することは困難です。ここでは、微小濃度の低濃度の濃度の組み合わせで処理することにより、段階およびテルフェーズのHeLa S3細胞が濃縮されていることを示しています。G1/S相でのチミジンブロックから9時間放出された後、40 ng/mLではなく20 ng/mLでノコダゾールを添加すると、ノコダゾール停止からの急速な放出が保証されます。その後、細胞は50μMブレビスタチンの存在下で20分間および50分間培養して、それぞれ無段線とテルフェースで細胞を濃縮します。ウエスタンブロット分析は、M期の進行中のホスホヒストンH3-SER10、リン酸塩A/B/C、およびサイクリンB1のダウンレギュレーションを検証します。さらに、SRCファミリーキナーゼC-YEとC-SRCの電気泳動移動度シフトが、有糸分裂の各段階でどのように変化するかを示します。これらの結果は、M相の進行中にタンパク質ダイナミクスを生化学的に調べるための有用な同期方法を提供します。

Mitosis is a continuous process to separate replicated chromosomes into two daughter cells through prophase, metaphase, anaphase, and telophase. Although a number of methods have been established to synchronize cells at different phases of the cell cycle, it is difficult to synchronize cells at the specific phases, anaphase and telophase, during mitosis because of the short duration of anaphase. Here, we show that HeLa S3 cells in anaphase and in telophase are successfully enriched by treatment with a combination of low concentrations of the microtubule-depolymerizing agent nocodazole and the myosin II inhibitor blebbistatin. After 9-h release from thymidine block at G1/S phase, addition of nocodazole at 20 ng/ml but not 40 ng/ml ensures rapid release from the nocodazole arrest. Subsequently, the cells are cultured in the presence of 50 μM blebbistatin for 20 and 50 min to enrich cells in anaphase and telophase, respectively. Western blot analysis verifies down-regulation of phospho-histone H3-Ser10, phospho-Aurora A/B/C, and cyclin B1 during M-phase progression. Furthermore, we show how the electrophoretic mobility shifts of the Src-family kinases c-Yes and c-Src can change in each phase of mitosis. These results provide a useful synchronization method for biochemically examining protein dynamics during M-phase progression.